葉冰瑩，薛 婷，陳 玲，張積森，陳由強(qiáng)*

（1.福建師范大 學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108；2.福建發(fā)育與神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108；3.農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108）

甘蔗（Saccharum officinarumL.）是熱帶與亞熱帶地區(qū)重要的糖料作物，是人類最早利用C4光合途徑的高光效禾本科甘蔗屬單子葉植物（禾本科是一類具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的種子植物家族），生物產(chǎn)量高，收益大，且在世界食糖總產(chǎn)量中，蔗糖占65%左右，我國(guó)則占80%以上。甘蔗理想的生物學(xué)特征，使其被視為具有巨大開發(fā)潛力的能源作物。許多研究表明甘蔗蔗糖積累機(jī)制、糖代謝過(guò)程及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制的研究能為甘蔗育種提供重要的理論基礎(chǔ)[3]。植物細(xì)胞的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（serine/threonine kinase，STK）幾乎參與所有的生理及病理過(guò)程（如糖代謝、細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)及基因表達(dá)等[4]）。研究甘蔗蛋白激酶中的絲氨酸蘇氨酸激酶基因可對(duì)甘蔗的代謝和發(fā)育信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑有較大的貢獻(xiàn)作用。

本研究基于比較基因組的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，從甘蔗中克隆獲得STK基因家族的cDNA片段及其對(duì)應(yīng)的基因組片段，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)甘蔗STK基因家族的組織表達(dá)差異性進(jìn)行分析，了解該家族中具體參與糖代謝調(diào)控影響較為重要的基因，初步研究探討STK在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用，尤其是STK在蔗糖代謝中的作用。

1 材料與試劑

1.1 植物材料與菌株

甘蔗（Saccharumsp.cultivar.FN41）品種由農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。大腸桿菌菌株DH5α由農(nóng)業(yè)部福建甘蔗生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑

Trizol購(gòu)自Invitrogen公司，焦碳酸二乙酯（DEPC）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，植物基因組DNA提取試劑盒、DNA Ladder購(gòu)自天根生化科技有限公司，pMD 19-T 載體、Ex Taq酶、rTaq酶、EcoRⅠ限制性內(nèi)切酶、EASYDilution均購(gòu)自TakaRa公 司，SV Gel and PCR Clean-Up System 購(gòu) 自Promega，Amp購(gòu)于上海生物工程公司，F(xiàn)irst strand cDNA Synthesis Kit、DNase Ⅰ購(gòu) 自Fermentas 公 司，F(xiàn)S Universal SYBR Green Master（熒光定量試劑盒）購(gòu)自Roche公司。其他生化試劑和常規(guī)試劑均為超純或分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 基因組的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

將擬南芥信息資源網(wǎng)TAIR搜索獲得的所有的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的轉(zhuǎn)錄序列，編碼域序列，基因位點(diǎn)序列與水稻基因組比對(duì)，獲得水稻的STK基因組序列、蛋白質(zhì)序列及完整的編碼域序列；再將高粱數(shù)據(jù)庫(kù)中的Sorbi1_GeneModels_Sbi1_4_aa.fasta protein 在BioEdit →Accesory Application→BLAST→Create a local protein database file→Local blast→將所有水稻STK蛋白序列上傳→Do search，得到所有高粱STK蛋白質(zhì)序列、轉(zhuǎn)錄序列。繼而與甘蔗已表達(dá)序列標(biāo)志（EST）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)依據(jù)高粱基因組與甘蔗ESTs設(shè)計(jì)引物，克隆出STK基因家族的編碼域序列（coding domain sequence，CDS）與基因組序列片段，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR分析STK家族組織表達(dá)差異性。

2.2 甘蔗光合參數(shù)的測(cè)定

通過(guò)乙烯利處理[5]九月齡甘蔗，利用光合測(cè)定儀（具體操作見說(shuō)明書）測(cè)定光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度、蒸騰速率的變化情況。

2.3 引物設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)選擇看家基因GAPDH為內(nèi)參照基因。看家基因GAPDH用作內(nèi)參基因來(lái)調(diào)整不同樣品最初的模板量以及RNA反轉(zhuǎn)錄的不同效率。依據(jù)實(shí)時(shí)定量PCR引物設(shè)計(jì)原則[6]，根據(jù)STK cDNA序列和GAPDH基因的mRNA序列，用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的特異性引物，用Oligo 6.0檢驗(yàn)其特異性。引物由上海生工合成，序列見表1。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的特異性檢測(cè)

根據(jù)Trizol說(shuō)明書提取蔗莖、蔗葉的總RNA，參照Prime ScriptTM 1st strand cDNA synthesis Kit試劑盒的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。使用引物OligdT 18，反轉(zhuǎn)錄條件為42℃、1h，70℃、5min，-80℃長(zhǎng)期保持。

在進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR之前，先用STK-F/STK-R進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和序列測(cè)定來(lái)檢測(cè)引物的特異性。PCR擴(kuò)增條件為：94℃變性5min后，按94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s進(jìn)行30輪循環(huán)，最后72℃延伸10min。10μL反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2μL；dNTP Mixture（2.5mmol/Leach）1.6μL；上下游引物（均為10μmol/L）各0.4μL；模板cDNA 1μL；rTaq（5U/μL）0.2μL；ddH2O補(bǔ)足20μL。反應(yīng)完成后，吸取3μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 STK和GAPDH實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Specific primers to amplify STK and GAPDH genes for FQ-PCR

2.5 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

用EASY Dilution將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物原液按4-1、4-2、4-3、4-4倍稀釋。根據(jù)不同模板在60℃條件下的反應(yīng)結(jié)果，確定PCR反應(yīng)的最適模板量。PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，選擇Dissociation模式，設(shè)置在60℃～95℃每隔0.2℃采集熒光值生成溶解曲線，依據(jù)溶解曲線來(lái)判斷最有反應(yīng)條件。

2.6 GAPDH基因和甘蔗STK基因?qū)崟r(shí)熒光PCR擴(kuò)增

條件優(yōu)化后可選擇4-1倍稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)，共3個(gè)平行，對(duì)GAPDH基因、STK基因進(jìn)行擴(kuò)增。在冰上配制反應(yīng)體系，且擴(kuò)增反應(yīng)在ABI 7300Fast Real-Time PCR System完成，擴(kuò)增程序?yàn)?5℃變性10min后，按95℃變性15s，60℃退火/延伸60s進(jìn)行40輪循環(huán)。在退火/延伸時(shí)采集熒光，反應(yīng)結(jié)束后選擇Relative Quantification（ddCt）Study模式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和修正。

2.7 甘蔗STK基因表達(dá)差異分析

以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參基因，福農(nóng)41成熟功能葉為校準(zhǔn)樣本，2-△△Ct法[7]分析基因表達(dá)水平，比較不同組織STK基因表達(dá)差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 基因組的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)

本研究搜索到所有的擬南芥STK基因序列33條，水稻71條，高粱192條。對(duì)各物種的STK基因序列進(jìn)行聚類分析，樹形顯示STK基因經(jīng)歷了廣泛的分化，并有可能經(jīng)歷了基因的水平轉(zhuǎn)移。通過(guò)以前實(shí)驗(yàn)克隆得到的甘蔗STK基因作為起始的源序列，Blast搜索高粱數(shù)據(jù)庫(kù)，得到了13條高粱STK基因的亞家族序列。最終，經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)排除疑似STK基因而不具有STK激酶的保守結(jié)構(gòu)域的序列，得到高粱STK亞家族的7條序列STK1-7（圖1）?，F(xiàn)STK6，7在分支圖上親源進(jìn)化程度相比STK1，2，3，4，5較遠(yuǎn)（分支圖上的序列從上之下依次為STK1-7）。將擬南芥、水稻、高粱STK基因家族的Groups和亞家族基因數(shù)總結(jié)為表2。繼而與甘蔗EST（Expressed Sequence Tag）數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)高粱基因組與甘蔗ESTs設(shè)計(jì)引物，克隆出STK基因家族的CDS（coding domain sequence）與基因組序列片段，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR分析STK家族組織表達(dá)差異性。

圖1 真正的高粱STK亞家族聚類分析Fig.1 The cluster analysis of true Sorghum STK Sub-family

表2 擬南芥、水稻、高粱STK基因家族的組和亞家族基因數(shù)Table 2 The Groups and sub-family genes inArabidopsis,Oryza Sativa andSorghum STK

3.2 甘蔗光合參數(shù)的測(cè)定

利用光合測(cè)定儀（ABI6400）測(cè)定乙烯利處理九月齡甘蔗的光合參數(shù)的變化見圖2。在乙烯利的處理?xiàng)l件下，光合速率下調(diào)，氣孔導(dǎo)度上調(diào)，胞間CO2上調(diào)，蒸騰速率下調(diào)，但是變化幅度不大。

3.3 甘蔗不同組織總RNA的提取及檢測(cè)

從圖3可以看出，甘蔗不同組織總RNA的電泳條帶清晰，28S帶明顯亮于18S帶，且無(wú)拖帶現(xiàn)象，表明提取的總RNA完整性較好，部分組織存在介于5S和18S之間的1～2條條帶，經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，A260/A230大于2，A260/A280為1.8～2.0，表明RNA中的蛋白質(zhì)和多糖含量較少，具有較高的純度，符合合成cDNA的要求。

圖2 乙烯利影響甘蔗光合參數(shù)的變化Fig.2 Ethephon influence sugarcane photosynthetic parameters change

3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物的特異性檢測(cè)

為驗(yàn)證反轉(zhuǎn)錄效果，在進(jìn)行定量PCR之前，采用GAPDH引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。取1μL擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶明顯，單一，無(wú)雜帶，亮度一致，且產(chǎn)物的大小與理論相符（圖4）。選擇STK6進(jìn)行不同組織的常規(guī)PCR，結(jié)果見圖5。1～6分別為根、老莖、嫩莖、嫩葉、鞘、芽，大小約200bp，條帶單一，較清晰，表明反轉(zhuǎn)錄效果良好，引物特異性好，可用于后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

圖3 Trizol試劑提取總RNA的電泳圖Fig.3 The agarose gel electrophoresisdetection of total RNA extracted by Trizol method

圖4 甘蔗GAPDH基因PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR products of GAPDH gene from sugarcane

圖5 STK6不同組織常規(guī)PCRFig.5 STK6 conventional PCR in different organizations

3.5 實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

分別選取稀釋不同倍數(shù)的不同基因的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，在預(yù)設(shè)條件溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，選取GAPDH的擴(kuò)增曲線（圖6）來(lái)判斷最優(yōu)稀釋倍數(shù)，4-0和4-1倍稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都可用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)，為了節(jié)省樣品量，本實(shí)驗(yàn)選擇4-1倍稀釋的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為后續(xù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)的模板，60℃為最適退火/延伸溫度。

3.6 甘蔗STK家族基因不同組織表達(dá)差異分析

經(jīng)過(guò)熒光定量PCR擴(kuò)增之后，收集退火/延伸時(shí)期的熒光參數(shù)，以根組織為參照，得到STK基因家族在不同組織的相對(duì)表達(dá)量的變化情況（圖7、圖8）。STK1：鞘＞老莖＞老葉＞嫩葉＞嫩莖＞芽＞根，STK2：嫩莖＞老莖＞鞘＞老葉＞嫩葉＞芽＞根，STK3：老葉＞鞘＞嫩莖＞嫩葉＞老莖＞根＞芽，STK4：鞘＞老莖＞老葉＞嫩莖＞嫩葉＞根＞芽，STK5：嫩葉＞鞘＞老葉＞芽＞嫩莖＞根＞老莖，STK6：鞘＞老葉＞嫩葉＞嫩莖＞芽＞根＞老莖，STK7：嫩莖＞老莖＞芽＞嫩葉＞鞘＞根＞老葉。該家族中各基因在各個(gè)組織中的表達(dá)情況是不同的，但多數(shù)基因是在鞘和嫩葉、嫩莖中表達(dá)量較高。STK2、STK7在莖中表達(dá)量高，STK3在老葉中表達(dá)量高，STK5的嫩葉表達(dá)量高，但與葉鞘和老葉差異不大。為了顯示STK基因家族在甘蔗各組織的表達(dá)情況，本實(shí)驗(yàn)采用SYBR Green Ⅰ染料法定量分析該基因家族各基因的表達(dá)情況。同一時(shí)間段同一植株取各組織樣品，且取3個(gè)平行植株，并混合所有樣品，以排除單株之間的差異。每次實(shí)驗(yàn)每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，對(duì)偏離比較嚴(yán)重的ΔCt值除去，然后取剩余2個(gè)的平均值，以排除在加樣過(guò)程中存在的偏差。另外，做3次獨(dú)立重復(fù)的實(shí)驗(yàn)，對(duì)比3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果后發(fā)現(xiàn)，基因表達(dá)量的差異小，由此證明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可靠。

圖6 GAPDH不同稀釋倍數(shù)的擴(kuò)增曲線圖Fig.6 GAPDH amplification plot of different dilution

圖7 STK家族基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCRFig.7 STK family gene real-time fluorescence quantitative PCR

圖8 STK2基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCRFig.8 STK 2 gene real-time fluorescence quantitative PCR

4 結(jié)論與討論

光合作用是植物體內(nèi)最為重要的同化過(guò)程，光合速率的測(cè)量是研究植物光合性能、診斷植物的光合機(jī)構(gòu)的運(yùn)轉(zhuǎn)、研究環(huán)境因素對(duì)光合作用的影響的重要方法[8]。本實(shí)驗(yàn)的九月齡甘蔗在乙烯利的處理下，光合速率下調(diào)，氣孔導(dǎo)度上調(diào)，胞間CO2上調(diào)，蒸騰速率下調(diào)，但是變化幅度不大，即乙烯利對(duì)光合作用影響不大，對(duì)光合產(chǎn)物的積累和轉(zhuǎn)化，糖代謝的信號(hào)調(diào)控的影響微弱。同時(shí)，在基因表達(dá)的分析中，RNA轉(zhuǎn)錄的穩(wěn)態(tài)水平是檢測(cè)細(xì)胞和組織的基因表達(dá)活性的最方便的參數(shù)之一[9-10]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，既能定性又能定量的優(yōu)勢(shì)使其成為基因轉(zhuǎn)錄水平研究的良好手段，其精確、快速的特點(diǎn)則使其目前在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[11-14]。本實(shí)驗(yàn)提取的甘蔗各組織RNA，通過(guò)分析STK基因家族在甘蔗各組織中的組織表達(dá)差異時(shí)發(fā)現(xiàn)，該家族中各基因在各個(gè)組織中特異表達(dá)的基因是不同的，但多數(shù)基因是在鞘和嫩葉、嫩莖中表達(dá)量較高。STK2、STK7在莖中表達(dá)量高，可能是參與莖中蔗糖貯存的主要STK基因；STK3在老葉中表達(dá)量高，STK5的嫩葉表達(dá)量高，但與葉鞘和老葉差異不大，這2個(gè)基因可能是參與葉中蔗糖轉(zhuǎn)化的主要STK基因。該4個(gè)基因可能在甘蔗糖代謝的信號(hào)調(diào)控中起主要作用。

本研究目的是通過(guò)光合參數(shù)測(cè)定來(lái)研究植物光合性能、診斷植物的光合機(jī)構(gòu)的運(yùn)轉(zhuǎn)、研究環(huán)境因素對(duì)光合作用的影響。通過(guò)測(cè)定STK基因在不同組織表達(dá)情況，分析甘蔗STK基因家族的組織表達(dá)差異。即使對(duì)于甘蔗STK基因的調(diào)控機(jī)制不是完全清楚，但是，甘蔗的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，在以碳水化合物收支平衡的基礎(chǔ)上，與蔗糖合成代謝相關(guān)酶，如蔗糖合成酶（SS）[15]、蔗糖磷酸合成酶（SPS）和轉(zhuǎn)化酶（Inv），這些酶基因都受到轉(zhuǎn)錄調(diào)控系統(tǒng)的支配，STK調(diào)控的信號(hào)轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可能調(diào)控著蔗糖合成代謝途徑。

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