周防震，謝園園，趙 婷，田夢(mèng)洋

（湖北民族學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北恩施 445000）

硒是人體必需的微量元素之一，具有維護(hù)心臟生理功能、增加免疫能力[1]、對(duì)抗異常細(xì)胞和致突變作用、對(duì)抗生物體內(nèi)有毒重金屬[2]、抗氧化[3]、抗癌、排毒解毒、保肝護(hù)肝[4]等作用。同時(shí)，硒對(duì)白內(nèi)障、心血管疾病、克山病、大骨節(jié)病、關(guān)節(jié)炎等疾病[5-6]也有一定的防治作用。但過(guò)量攝入硒會(huì)產(chǎn)生中毒癥狀[7]，故對(duì)硒的補(bǔ)充利用需慎重。

研究表明，無(wú)機(jī)硒毒性強(qiáng)、吸收低而有機(jī)硒則較為安全[8]。目前有機(jī)硒的獲得運(yùn)用較多的是培養(yǎng)富硒酵母[9]。富硒益生菌是一種借助益生菌將無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)變成有機(jī)硒，具有有機(jī)硒和益生菌雙重作用[10]。實(shí)驗(yàn)以富硒礦床土壤為樣品，從富硒微生物的篩選、鑒定及富硒條件優(yōu)化方面展開(kāi)研究，以期篩選一株天然富硒微生物，為利用微生物富集合成有機(jī)硒提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

土壤樣本采集于湖北恩施雙河鄉(xiāng)漁塘壩富硒礦床，獲得的菌種現(xiàn)保存于湖北民族學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。Na2SeO3購(gòu)于美國(guó)invitrogen公司，Tris、十六烷基三甲基溴化銨（cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、溴乙啶染液、蛋白酶K、瓊脂糖、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、飽和酚、氯仿、異戊醇購(gòu)于日本TAKARA公司，其他試劑購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)，引物合成由美國(guó)invitrogen公司完成。

1.2 儀器與設(shè)備

SHZ-2AS恒溫振蕩器：江蘇金壇環(huán)宇科學(xué)儀器廠(chǎng)；DL-5-B低速大容量離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng)；SPX-250B-D型振蕩培養(yǎng)箱：蘇州江東精密儀器有限公司；BL-50G型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DYY-10C型電泳儀：北京市六一儀器廠(chǎng)；Applied Biosystems 2720 Thermal cycler PCR儀：美國(guó)ABI公司；ChemiDoc XRS凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 耐硒微生物的篩選

在恩施雙河鄉(xiāng)漁塘壩硒礦床采集土壤樣本，用無(wú)菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）懸浮，加入玻璃珠，25℃、180r/min振蕩30min，靜置2min，待沙礫和大顆粒沉降后收集懸浮液，懸浮液5000r/min離心8min，沉淀用5mL PBS懸浮，4℃保存?zhèn)溆?。?mL制備好的樣品分別加入含150μg/mL Na2SeO3的100mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)2d。5%接種量繼代培養(yǎng)4次后，稀釋平板培養(yǎng)結(jié)合劃線(xiàn)分離[9]，得到耐硒微生物的純培養(yǎng)體。

1.3.2 耐硒菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)測(cè)定

從斜面上挑取菌株分別接種于含100mL新鮮液體馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[11]的三角瓶中，于30℃活化12h后，吸取0.5mL分別接種于裝有10mL液體培養(yǎng)基的大試管中，取出1管于4℃保藏，其余各管在39℃恒溫培養(yǎng)。此后每隔1h取出1管4℃保藏。待全部取出后，用分光光度計(jì)在波長(zhǎng)530nm處測(cè)定吸光度值，繪制耐硒菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.3.3 適宜硒質(zhì)量濃度的測(cè)定

耐硒菌活化后，按5%接種量接種于含硒量為15μg/mL、30μg/mL、60μg/mL、120μg/mL的裝于大試管中的10mL液體培養(yǎng)基中。于39℃恒溫培養(yǎng)12h后，根據(jù)菌液顏色變化確定適宜硒質(zhì)量濃度。

1.3.4 硒含量的測(cè)定

菌體經(jīng)過(guò)硝解反應(yīng)后用原子熒光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可得樣液的硒質(zhì)量濃度，由轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式可得，經(jīng)富硒試驗(yàn)后的耐硒菌的有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率[10]。

1.3.5 富硒能力的優(yōu)化

選取對(duì)富硒能力影響較大的硒質(zhì)量濃度、培養(yǎng)溫度和加硒時(shí)間3個(gè)因素做正交試驗(yàn)。以菌體含硒量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化富硒條件。將活化的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的耐硒菌5mL接種于45mL培養(yǎng)液中，待加入硒后，繼續(xù)培養(yǎng)12h后取出，3000r/min離心30min，濾去上清液，保存菌體，備用。

1.3.6 富硒微生物的鑒定

CTAB法提取富硒細(xì)菌基因組DNA參照蔡劉體等[12]的方法進(jìn)行。16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃/5min；94℃/30s；53℃/40s；72℃/120s；30循環(huán)；72℃/10min。擴(kuò)增引物為通用引物F8（5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和R1492（5’-ACCTTGTTACGACTT-3’）。擴(kuò)增產(chǎn)物送美國(guó)invitrogen公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將所得序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（NationalCenterofBiotechnologyInformation，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，進(jìn)行菌種鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 11.0軟件，計(jì)量資料試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行單因素方差分析，多因素間進(jìn)行方差與極差分析。并用Origin8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐硒菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

由耐硒菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)（圖1）可以看出，耐硒菌在5h～8h時(shí)處于對(duì)數(shù)期，8h～12h時(shí)處于穩(wěn)定期。因?qū)?shù)期菌體代謝旺盛，轉(zhuǎn)化率高，衰亡期菌體大量自溶，轉(zhuǎn)化率低，且加硒時(shí)間越早對(duì)菌體代謝活動(dòng)抑制越強(qiáng)，從轉(zhuǎn)化率和生產(chǎn)周期考慮，選擇第6h為加硒時(shí)間。

圖1 耐硒菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Fig.1 Growth curve of selenium-tolerant microbe

2.2 適宜硒質(zhì)量濃度的確定

觀察不同硒質(zhì)量濃度的液體培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)隨硒質(zhì)量濃度增加，菌體變紅有增加趨勢(shì)。120μg/mL時(shí)紅色較深，60μg/mL微紅，30μg/mL紅色不明顯，15μg/mL沒(méi)變紅。為避免過(guò)多無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為單質(zhì)硒，提高有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率，認(rèn)為15μg/mL～25μg/mL可能為合適的硒濃度。

2.3 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

原子熒光光度計(jì)測(cè)定硒濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)見(jiàn)圖2，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程為Y=27.03583C+6.0683，R2為0.99962。

圖2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Standard curve of Selenium

2.4 富硒條件優(yōu)化正交試驗(yàn)優(yōu)化

根據(jù)單因素預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取加硒質(zhì)量濃度、加硒時(shí)間和培養(yǎng)溫度進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal array design

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Result and analysis of orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance for the orthogonal experiment results

由表2可知，3個(gè)因子對(duì)菌體富硒量影響大小依次為C＞A＞B，即培養(yǎng)溫度＞加硒濃度＞加硒時(shí)間；最佳工藝為A2B1C2，即選用培養(yǎng)至5h時(shí)加20μg/mL硒，在37℃培養(yǎng)12h。由表3可知，加硒濃度、加硒時(shí)間和培養(yǎng)溫度這3個(gè)因素對(duì)菌體富硒量的都具有顯著影響（p＜0.05）。在最佳條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，菌體硒含量平均為0.7108μg/mL，富硒率為58.3%，因此可得最優(yōu)水平可靠且該工藝穩(wěn)定可行。

2.5 富硒微生物的鑒定

顯微鏡檢發(fā)現(xiàn)富硒微生物為桿狀，革蘭氏染色后，菌種呈紫色，說(shuō)明該菌種是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。對(duì)菌種進(jìn)行活化，提取細(xì)菌總DNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖3。表明細(xì)菌基因總DNA提取成功。以提取的細(xì)菌總DNA為模板，以通用引物F8和R1492擴(kuò)增16S rRNA基因序列，擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖4。3次重復(fù)均未發(fā)現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，且擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致，表明擴(kuò)增專(zhuān)一性良好，將PCR產(chǎn)物送至華大基因測(cè)序中心，測(cè)序得到細(xì)菌16S rRNA的堿基序列，其長(zhǎng)度為1389bp，將序列在NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，結(jié)合形態(tài)學(xué)的觀察，認(rèn)為該富硒菌為一種枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

圖3 富硒菌總DNA凝膠電泳圖譜Fig.3 Agarose gel electrophoretic of total DNA for seleniumenriched microbe

圖4 富硒菌16S rRNA基因擴(kuò)增片段圖譜Fig.4 DNA fragments amplified by F8/R1492 for selenium-enriched microbe

3 結(jié)論

世界上有40多個(gè)國(guó)家和地區(qū)缺硒，我國(guó)有72%的縣是低硒或缺硒地區(qū)[13]。給缺硒地區(qū)的人民適當(dāng)補(bǔ)硒可取得良好的醫(yī)療效果。由于無(wú)機(jī)硒的毒性很強(qiáng)，吸收率又低，因此補(bǔ)硒時(shí)把有機(jī)硒視為最安全有效的手段。目前有機(jī)硒的獲得包括微生物轉(zhuǎn)化法、植物轉(zhuǎn)化法[14]和動(dòng)物轉(zhuǎn)化法等。微生物轉(zhuǎn)化法中較多的是利用酵母[9]和乳酸菌[10]，而利用其他微生物進(jìn)行富硒未見(jiàn)報(bào)道。

湖北恩施是富硒地區(qū)，被譽(yù)為“世界硒都”。本實(shí)驗(yàn)從恩施富硒礦區(qū)土壤中篩選一株富硒芽孢桿菌，通過(guò)富硒工藝條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)溫度對(duì)菌體富硒量影響最大，加硒濃度次之，而加硒時(shí)間的影響不顯著，同時(shí)獲得最大富硒量的最適條件為加硒濃度20μg/mL，加硒時(shí)間為培養(yǎng)5h以后，培養(yǎng)溫度37℃，在此條件下培養(yǎng)菌體硒含量平均為0.7108μg/mL，富硒率為58.3%。這些結(jié)果進(jìn)一步豐富了利用微生物進(jìn)行生物富硒的研究，為硒資源的開(kāi)發(fā)和利用提供了一定的基礎(chǔ)。

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