梅光明，郭遠(yuǎn)明，饒勝其，張小軍，李佩佩，嚴(yán)忠雍，龍 舉

（1.浙江省海洋水產(chǎn)研究所 浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實驗室，浙江 舟山 316100；2.揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009）

自然發(fā)酵腐乳也叫腐乳、醬豆腐，為中國著名的傳統(tǒng)食品，由新鮮豆腐經(jīng)過發(fā)酵、腌制而成，有“東方奶酪”之稱[1-2]。腐乳的制作過程中有霉菌、乳酸菌和酵母菌等多種微生物共同參與發(fā)酵作用[3-5]。5’-AMP脫氨酶又稱腺苷酸脫氨酶、5’-AMP氨基水解酶，是構(gòu)成嘌呤核苷酸代謝循環(huán)的3種主要酶類之一。在核酸酶水解核酸制備5’-核苷酸的工業(yè)化生產(chǎn)過程中，約占總量25%的腺苷酸通常沒有多大用途，而5’-AMP脫氨酶可專一性地將腺苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤账?，后者可用來生產(chǎn)藥品及強(qiáng)力味精，此外脫氨酶還用于生產(chǎn)細(xì)胞的H+緩沖劑[6]。當(dāng)今核酸酶的研究炙手可熱且成果產(chǎn)出速度飛速提高，勢必導(dǎo)致市場對5’-AMP脫氨酶的需求大大增加，因此大規(guī)?；厣a(chǎn)5’-AMP脫氨酶具有廣泛的生產(chǎn)應(yīng)用前景和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)中使用的生物酶大多由酵母、青霉、曲霉及毛霉等微生物發(fā)酵制備，但有關(guān)生產(chǎn)工藝的報道卻比較少。本實驗利用自然發(fā)酵腐乳中富集的豐富微生物資源，參考相關(guān)文獻(xiàn)資料報道的微生物篩選目標(biāo)菌株的方法[7-21]，采用3種固體培養(yǎng)基（PDA、YPD、MRS）對腐乳中的野生菌株進(jìn)行篩選和平板分離劃線培養(yǎng)，使具有不同菌落特征的菌種分離純化后，測得各菌株5’-AMP脫氨酶的產(chǎn)量與活性表達(dá)，篩選出5’-AMP脫氨酶的高產(chǎn)菌株，并對其進(jìn)行菌種鑒定及一系列的發(fā)酵條件優(yōu)化研究。通過本實驗得到一株具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高產(chǎn)5’-AMP脫氨酶菌株，為進(jìn)一步研究5’-AMP脫氨酶的性質(zhì)做準(zhǔn)備，并推動其工業(yè)化生產(chǎn)步伐奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

從自然發(fā)酵腐乳中分離。

1.2 培養(yǎng)基制備

PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min。。

MRS固體培養(yǎng)基：牛肉膏10.0g，蛋白胨10.0g，酵母浸膏5.0g，K2HPO42.0g，檸檬酸氫二銨2.0g，乙酸鈉5.0g，吐溫-801.0mL，MgSO4·7H2O0.50g，MnSO40.25g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min，調(diào)節(jié)pH值至6.2～6.4。

YPD固體培養(yǎng)基：蛋白胨20.0g，酵母浸膏10.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂20.0g，蒸餾水1000mL，121℃滅菌20min，調(diào)節(jié)pH值至5.0～5.5。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基：木糖2.1%，檸檬酸三鈉0.28%，蛋白胨1.4%，硫酸鎂0.035%，吐溫0.084%。121℃滅菌20min。

1.3 試劑

酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白胨、腺苷酸和瓊脂均為生化試劑，其余試劑為分析純。

0.1 mol/L琥珀酸-氫氧化鈉緩沖液：稱取琥珀酸11.809g，加蒸餾水約950mL溶解，用1mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，定容至1000mL。

0.08 mol/L NaHCO3：稱取NaHCO36.72g，用蒸餾水溶解，定容至1000mL。

10%高氯酸溶液：稱取10.0mL高氯酸，加適量水稀釋，定容至100mL。

5’-AMP反應(yīng)底物：準(zhǔn)確稱取139mg腺苷酸，用0.08mol/L NaHCO3溶液定容至10mL，作為原始底物，然后用0.1mol/L琥珀酸-氫氧化鈉緩沖液將其稀釋400倍，得到最終濃度為0.1×10-3mol/L 的反應(yīng)底物。

1.4 儀器與設(shè)備

TG16-WS型臺式高速離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；DK-S12型電熱恒溫水浴器：上海森信試驗儀器有限公司；SX-500型高壓蒸汽滅菌鍋：日本TOMMY公司；DGX-9053B-2型生化培養(yǎng)箱：上海福瑪試驗設(shè)備有限公司；BS210S型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；ZHJH-C1209B型垂直流超凈工作臺：上海智誠分析儀器制造有限公司；755S紫外-可見分光光度計：上海棱光技術(shù)有限公司。

1.5 方法

1.5.1 自然發(fā)酵腐乳半成品的制備

稱取500g市售新鮮豆腐，表面用經(jīng)滅菌處理的自來水淋洗干凈后切成大小適中的小塊，放置于干凈塑料盒內(nèi)（塑料盒底部預(yù)先放好一層干凈報紙并鋪上食品保鮮膜），在豆腐表面再鋪上一層保鮮膜后再放上一層報紙。蓋好塑料盒蓋子后在16℃、濕度85%左右的條件下放置培養(yǎng)5d[22]。

1.5.2 自然發(fā)酵腐乳半成品中產(chǎn)5’-AMP脫氨酶菌株的篩選

取樣：從腐乳半成品上選取菌落特征差別較大的多個點(diǎn)，分別取樣品2g左右于50mL錐形瓶中，加入無菌生理鹽水10mL，室溫條件下120r/min搖床提取30min，以此為菌懸液原液。將菌懸液原液按濃度梯度依次稀釋至10-1～10-7。分別取稀釋度為10-5～10-7的3種樣液350μL，用涂布棒均勻涂布于PDA、MRS、YPD培養(yǎng)基。涂布完成后，置于20℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2h～3h，待水分蒸發(fā)干后，將培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)48h。

分離純化：選擇涂布濃度適宜的平板，挑取形態(tài)完整、單獨(dú)生長的菌落分別劃線。用接種環(huán)以無菌操作沾取少許待分離的菌，在與涂布平板對應(yīng)培養(yǎng)基的無菌平板表面進(jìn)行平行劃線，微生物細(xì)胞數(shù)量將隨著劃線次數(shù)的增加而減少，并逐步分散開來。劃線完成后置于20℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)2d～3d。重復(fù)劃線培養(yǎng)操作2次，使菌株盡量純化。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：本試驗使用250mL錐形瓶，每瓶裝入約50mL搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，從劃線平板接種后，20℃、200r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24h后轉(zhuǎn)接5%至新的搖瓶中，繼續(xù)搖瓶發(fā)酵3d，培養(yǎng)完成，取樣測量5’-AMP脫氨酶的活性。

菌種保藏及酶液制備：分別取搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)后的菌懸液1mL于1.5mL離心管中，10000r/min離心5min，下層沉淀加500μL 30%甘油，振蕩均勻后于-20℃冰箱中保藏，即為種子。甘油保藏適用于中期或長期保藏菌種。而上層清液即是酶液，可用于測定5’-AMP脫氨酶的活性。

5’-AMP脫氨酶活性的測定：將酶液樣品稀釋8倍備用，按照文獻(xiàn)[23]的方法測定5’-AMP脫氨酶的活性，每個樣品做3組平行實驗，平行實驗數(shù)據(jù)分別計算得到酶活后取平均值。

1.5.3 菌種鑒定

在倒好培養(yǎng)基平皿中，用接種針從斜面挑取少許孢子在培養(yǎng)皿中按三角頂點(diǎn)位置三點(diǎn)式接種。PDA培養(yǎng)基平皿在20℃培養(yǎng)3d～5d。形成菌落后進(jìn)行特征觀察并記錄。對5’-AMP脫氨酶高產(chǎn)菌株進(jìn)行分類鑒定

1.5.4 發(fā)酵條件對5’-AMP脫氨酶高產(chǎn)菌株產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基初始pH值對產(chǎn)酶的影響：挑取單獨(dú)生長的純種菌落于裝有50mL不同pH值的液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，錐形瓶用8層紗布封口。20℃、200r/min搖床培養(yǎng)24h。發(fā)酵培養(yǎng)24h后，轉(zhuǎn)接5%（v/v，下同）至新的裝有約50mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)72h。培養(yǎng)后的酶液用于測定5’-AMP脫氨酶的活性。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響：操作同1.5.4，比較不同溫度條件下?lián)u床培養(yǎng)的酶液酶活大小。

接種量對產(chǎn)酶的影響：操作同1.5.4，比較不同接種量至裝有約50mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)72h后的酶液酶活大小。

搖瓶發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響：操作同1.5.4，比較轉(zhuǎn)接5%至裝有約50mL液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)的時間長短對培養(yǎng)后的酶液酶活大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆腐乳半成品制備及取樣點(diǎn)設(shè)置

圖1 市售新鮮豆腐（a）及放置5d后自然發(fā)酵腐乳半成品（b）Fig.1 Fresh tofu (a) and semi-finished tofu products after 5d natural fermentation (b)

市售新鮮豆腐見圖1a，放置5d后自然發(fā)酵腐乳半成品見圖1b。由圖1b可知，此時腐乳上的微生物已經(jīng)生長十分旺盛。選取具有明顯菌落特征的取樣點(diǎn)，共計7個，分別記為A、B、C、D、E、F、G。

圖2 特征性涂布平板Fig.2 Characteristic coated tablet

圖2a為在YPD培養(yǎng)基上涂布分離豆腐乳中野生菌株的典型情況；圖2b為在MRS培養(yǎng)基上涂布分離豆腐乳中野生菌株的典型情況；圖2c為在PDA培養(yǎng)基上涂布分離豆腐乳中野生菌株的典型情況。

涂布完成后，挑取涂布平板上生長單一的特征菌落，依據(jù)純化情況，劃線2次或3次。共得到單一菌株36株，從PDA平板上得到20株，YPD平板上得到9株，MRS平板上得到7株。根據(jù)培養(yǎng)基種類不同，依次編號為DFP-101～120（PDA培養(yǎng)基），同樣有DFY-101～109（YPD培養(yǎng)基），DFM-101～107（MRS培養(yǎng)基）。

2.2 腐乳分離菌株的酶活測量結(jié)果

從自然發(fā)酵腐乳中篩選得到單一菌株共36株，在接種量5%，20℃、200r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件下發(fā)酵72h，分別測得5’-AMP脫氨酶活性，結(jié)果見表1。

表1 具有產(chǎn)酶能力的菌株酶活測量結(jié)果Table 1 Enzyme activity measurements of strains with ability of enzyme production

實驗結(jié)果表明，具有5’-AMP脫氨酶活性的共計18株，且這些具有5’-AMP脫氨酶產(chǎn)酶能力的菌株多數(shù)在PDA培養(yǎng)基上篩選得到，說明產(chǎn)5’-AMP脫氨酶的菌株較多為霉菌。編號為DFP-102的菌株為5’-AMP脫氨酶的最高產(chǎn)菌株，在上述發(fā)酵條件下，5’-AMP脫氨酶的活力達(dá)到359.1U/mL。故選取此菌株進(jìn)行下一步的發(fā)酵優(yōu)化及菌種鑒定試驗。

2.3 菌種初步鑒定結(jié)果

圖3 DFP-102菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of DFP-102

圖3a為DFP-102的PDA培養(yǎng)基三點(diǎn)式培養(yǎng)菌落圖，圖3b為圖3a右上角菌落的放大圖。觀察DFP-102的菌落形態(tài)：灰色絮狀，菌落中間有小圓，邊緣呈白色，有同心圓，反面淺黃色。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)資料[24-25]初步鑒定DFP-102分離菌株是毛霉菌屬。

2.4 發(fā)酵條件對DFP-102菌株產(chǎn)酶的影響

2.4.1 發(fā)酵液初始pH值對產(chǎn)酶的影響

按照1.5.4的方法實驗操作，結(jié)果（圖4）可知，在pH值為4.0～6.0時，酶活隨pH值的增加而增加，在pH值為6.0時，酶活達(dá)到最大值，此時5’-AMP脫氨酶活是359.1U/mL，當(dāng)pH值高于6.0以后，酶活隨pH值的增加而下降。因此培養(yǎng)液的初始pH值確定為6.0。

2.4.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響

按照1.5.4的方法實驗操作，結(jié)果（圖5）可知，在18℃～24℃時，隨著溫度的上升，5’-AMP脫氨酶活性逐漸上升，在24℃時，酶活達(dá)到最高，此時5’-AMP脫氨酶活是390.6U/mL。隨溫度繼續(xù)上升，5’-AMP脫氨酶活性逐漸下降。因此搖床發(fā)酵培養(yǎng)溫度應(yīng)控制為24℃左右。

圖4 發(fā)酵液初始pH值對酶活的影響Fig.4 Effect of initial pH value of the fermented liquid on enzyme activity

圖5 發(fā)酵溫度對酶活的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on enzyme activity

2.4.3 接種量對產(chǎn)酶的影響

圖6 接種量對酶活的影響Fig.6 Effect of inoculum on enzyme activity

按照1.5.4的方法實驗操作，結(jié)果（圖6）可知，接種量大于5%后，隨著接種量的增加，酶活開始降低，因此接種量應(yīng)選為5%，此時5’-AMP脫氨酶活性是390.6U/mL。

2.4.4 搖瓶發(fā)酵時間對產(chǎn)酶的影響

按照1.5.4的實驗方法操作，結(jié)果（圖7）可知，在12h～48h內(nèi)，隨著時間的延長，酶的活性逐漸提高，發(fā)酵48h時酶活最高，此時5’-AMP脫氨酶活是472.3U/mL，繼續(xù)延長發(fā)酵時間，酶活逐漸降低，因此發(fā)酵培養(yǎng)時間確定為48h。

圖7 發(fā)酵時間對酶活的影響Fig.7 Effect of fermentation time on enzyme activity

3 結(jié)論

本研究從自制的自然發(fā)酵腐乳中進(jìn)行菌株的分離與純化，篩選出單一菌株36株，其中檢測到具有5’-AMP脫氨酶活性的有18株。酶活最高的菌株為DFP-102（初步鑒定為毛霉菌屬，酶活為359.1U/mL）。經(jīng)過搖床發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化，DFP-102菌株產(chǎn)5’-AMP脫氨酶的最適宜發(fā)酵條件為培養(yǎng)基pH值為6.0，發(fā)酵溫度24℃，發(fā)酵時間48h，5%接種量。在該最佳發(fā)酵條件培養(yǎng)菌株后，5’-AMP脫氨酶活性可達(dá)472.3U/mL。本研究篩選得到的高產(chǎn)5’-AMP脫氨酶活性菌株來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，具有較低的食品安全風(fēng)險，且采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法，生產(chǎn)周期較短，有利于5’-AMP脫氨酶大規(guī)?；a(chǎn)并降低生產(chǎn)成本。后續(xù)將開展進(jìn)一步的研究工作，包括DFP-102菌株的生化鑒定，嘗試對DFP-102進(jìn)行菌株誘變得到更高的5’-AMP脫氨酶高產(chǎn)菌株，對于5’-AMP脫氨酶的性質(zhì)研究，如穩(wěn)定性，耐熱性等也有待進(jìn)一步展開。本研究為5’-AMP脫氨酶的性質(zhì)研究以及工業(yè)化生產(chǎn)打下了一定的基礎(chǔ)。

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