王金菊，黃 劍，李 超，王艷萍*

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

灰樹(shù)花（Grifola frondasa）又名貝葉多孔菌（polyporus frondosus）。其外觀灰白色，如卷心菜大，風(fēng)味獨(dú)特，是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的珍奇食藥兩用菌之一[1]?；覙?shù)花的多種營(yíng)養(yǎng)素居各種食用菌之首[2]，灰樹(shù)花具有極高的醫(yī)療保健功能。從20世紀(jì)80年代開(kāi)始，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了大量研究，從灰樹(shù)花子實(shí)體和菌絲體中提取了幾十種活性多糖[3-4]。經(jīng)過(guò)大量的化學(xué)和藥理藥效研究證明，灰樹(shù)花發(fā)酵液中的活性多糖具有明顯的抗腫瘤[5]、抗HIV病毒[6]、改善免疫系統(tǒng)[7]、降血脂[8]、降血糖和降膽固醇[9-10]等生物活性，而其抗疲勞的效果鮮見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

運(yùn)動(dòng)耐力實(shí)驗(yàn)和生化指標(biāo)的測(cè)定是評(píng)價(jià)疲勞的2個(gè)主要方法，負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)是運(yùn)動(dòng)耐力實(shí)驗(yàn)的方法之一，游泳時(shí)間的長(zhǎng)短可以反應(yīng)動(dòng)物運(yùn)動(dòng)疲勞的程度[11]。在生化指標(biāo)的評(píng)價(jià)中，血清尿素氮（SUN）的含量主要反映機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)的代謝情況，機(jī)體在長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)動(dòng)后就會(huì)開(kāi)始消耗體內(nèi)蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生大量的SUN，機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)性越低，形成的尿素越多；反之，機(jī)體運(yùn)動(dòng)后SUN含量越低，表明機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的適應(yīng)能力強(qiáng)，疲勞的產(chǎn)生就會(huì)得到延緩。乳酸脫氫酶（LDH）可以氧化機(jī)體血液中的乳酸，從而降低血液中乳酸的含量，使機(jī)體回復(fù)正常的pH值水平，故LDH活性的增強(qiáng)可以大大加速血液乳酸的清除速率，進(jìn)而提高機(jī)體的抗疲勞能力[12-13]。本研究通過(guò)小鼠負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)、SUN、LDH指標(biāo)的測(cè)定及跑籠實(shí)驗(yàn)探究灰樹(shù)花發(fā)酵液的抗疲勞活性，為灰樹(shù)花發(fā)酵液在功能性食品中的應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

灰樹(shù)花菌株（Grifola frondosa）由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小鼠60只，雄性，體質(zhì)量（20±2）g，中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供；許可證號(hào)：SCXK-（軍）2010-025。動(dòng)物飼養(yǎng)在天津科技大學(xué)清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房完成（環(huán)境設(shè)施合格證號(hào)：SYXK（津）2006-0005）。

1.1.3 試劑與主要儀器

乳酸脫氫酶試劑盒、尿素氮試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；DELTA-320型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司；回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；7L氣升式發(fā)酵罐（上海保興7L）：上海保興公司；SM-510型全自動(dòng)滅菌鍋：日本YAMATO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 灰樹(shù)花發(fā)酵液的制備

發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖22g/L，蛋白胨3g/L，KH2PO40.8g/L；MgSO41.2g/L，115℃高壓滅菌30min，將種子發(fā)酵液按10%（v/v）接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25℃、140r/min發(fā)酵培養(yǎng)14d，抽濾去除菌體，得到灰樹(shù)花發(fā)酵液。將發(fā)酵液進(jìn)行旋蒸，濃縮至固形物含量為4%（w/v）和8%（w/v），分別作為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的低濃度組和高濃度組待試樣品。

1.2.2 動(dòng)物分組與給藥

將小鼠隨機(jī)分為空白組、灰樹(shù)花發(fā)酵液低濃度和高濃度組，每組各12只。樣品組分別灌喂0.2mL低濃度和高濃度的發(fā)酵液，空白組灌喂相同體積的生理鹽水，連續(xù)灌喂25d，小鼠正常的飲食和攝水，25d后測(cè)定小鼠的體質(zhì)量。

1.2.3 負(fù)重游泳實(shí)驗(yàn)

每組選用6只小鼠，末次給予小鼠受試物30min后，置小鼠于游泳箱中游泳，水深為35cm，水溫為（25.0±0.5）℃，鼠尾根部負(fù)荷5%（w/w）體質(zhì)量的鉛皮。記錄小鼠從游泳開(kāi)始至力竭的時(shí)間，作為小鼠游泳力竭時(shí)間。

力竭標(biāo)準(zhǔn)：小鼠沉入水面以下8s，無(wú)法上浮。

1.2.4 血尿素氮（BUN）和乳酸脫氫酶（LHD）的測(cè)定

每組選用6只小鼠，末次給予小鼠受試物30min后，在溫度為（30±0.5）℃的水中不負(fù)重游泳90min，休息60min后，采血清0.5mL，依照BUN和LHD試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5 灰樹(shù)花發(fā)酵液與同類產(chǎn)品的抗疲勞效果比較

將小鼠隨機(jī)分為空白組、發(fā)酵組、佳得樂(lè)組（陽(yáng)性對(duì)照）和紅牛組（陽(yáng)性對(duì)照），每組各12只。發(fā)酵液組灌喂0.2mL發(fā)酵液（濃縮至固形物含量為8%），其他各組分別灌以相同體積的生理鹽水、佳得樂(lè)和紅牛，每天灌胃1次，連續(xù)25d后測(cè)定小鼠體質(zhì)量、負(fù)重游泳試驗(yàn)、BUN和LHD含量，具體測(cè)定方法參考1.2.3和1.2.4。

1.2.6 跑籠實(shí)驗(yàn)研究抗疲勞效果

將小鼠隨機(jī)分為空白組、發(fā)酵液組、佳得樂(lè)組（陽(yáng)性對(duì)照）和紅牛組（陽(yáng)性對(duì)照），每組各6只。發(fā)酵液組灌胃0.2mL發(fā)酵液（濃縮至固形物含量為8%（w/v）），其他各組分別灌以相同體積的生理鹽水、佳得樂(lè)和紅牛，每天灌喂1次，連續(xù)25d后，將跑鼠籠置于水槽內(nèi)使其1/3浸沒(méi)于水面之下，并使水溫控制在（15±2）℃。經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定小鼠的疲勞閾值為跑籠速度2r/min，當(dāng)小鼠運(yùn)動(dòng)速度低于閾值時(shí)，認(rèn)為其處于疲勞狀態(tài)。小鼠灌胃后8min跑籠，測(cè)定其跑籠速度和跑籠時(shí)間。因飲料功效不同，跑籠速度快，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可認(rèn)為該飲料對(duì)疲勞小鼠體力恢復(fù)的效果好。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度發(fā)酵液對(duì)小鼠抗疲勞能力的影響

2.1.1 灰樹(shù)花發(fā)酵液對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表1 灰樹(shù)花發(fā)酵液對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(±s,n=12)Table 1 Effect of broth on body weight of mice(±s,n=12)

表1 灰樹(shù)花發(fā)酵液對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(±s,n=12)Table 1 Effect of broth on body weight of mice(±s,n=12)

注：與空白組相比較，“*”表示p＞0.05。

表1顯示，3組小鼠灌喂25d后體質(zhì)量均有增加，但與空白對(duì)照組比較，低濃度組和高濃度組在體質(zhì)量上無(wú)顯著性差異。表明灰樹(shù)花發(fā)酵液對(duì)小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)無(wú)顯著影響。

2.1.2 對(duì)負(fù)重游泳力竭時(shí)間、BUN及LHD的影響

表2 發(fā)酵液對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 2 Effect of broth on exhausted time of mice in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

表2 發(fā)酵液對(duì)小鼠負(fù)重游泳力竭時(shí)間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 2 Effect of broth on exhausted time of mice in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

注：與空白組相比較，“*”表示p＜0.05。

從表2可以看出，對(duì)于游泳力竭時(shí)間，t(高濃度組)＞t(低濃度組)＞t(空白組)，與空白組相比，高濃度組有顯著性差異，但低濃度組與空白組相比沒(méi)有顯著性差異。無(wú)論從各組的均值還是顯著性差異來(lái)看，高濃度的灰樹(shù)花發(fā)酵液是有助于延長(zhǎng)力竭游泳時(shí)間。

通過(guò)BUN濃度的比較可以發(fā)現(xiàn)，C(高濃度組)＜C(空白組)＜C(低濃度組)，與空白組相比，高濃度組BUN濃度具有顯著性差異（p＜0.05）；但低濃度組與空白對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異（p＞0.05），這說(shuō)明高濃度的灰樹(shù)花發(fā)酵液是有助于緩解蛋白質(zhì)與氨基酸分解代謝，增強(qiáng)了對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)性。此外，對(duì)于各組小鼠的LHD活力，U(低濃度)＞U(高濃度)＞U(空白組)，低濃度組和高濃度組的LHD活力都很高；與空白組相比，高濃度組和低濃度組都具有顯著性差異（p＜0.05），但是高濃度組和低濃度組之間無(wú)顯著性差異，也就是說(shuō)，說(shuō)明灰樹(shù)花發(fā)酵液有助于減少運(yùn)動(dòng)后乳酸在肌肉中的堆積，提高小鼠對(duì)負(fù)荷的適應(yīng)性，從而緩解疲勞狀態(tài)。

2.2 發(fā)酵液與同類產(chǎn)品的抗疲勞效果比較

2.2.1 各樣品對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

表3 發(fā)酵液、佳得樂(lè)和紅牛對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(±s,n=12)Table 3 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on body weight of mice (±s,n=12)

表3 發(fā)酵液、佳得樂(lè)和紅牛對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響(±s,n=12)Table 3 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on body weight of mice (±s,n=12)

注：與空白組相比較，“*”表示p＜0.05。

由表3可以看出，4組小鼠給藥25d后體質(zhì)量均有增加，與空白組相比，發(fā)酵液組和陽(yáng)性組都無(wú)顯著性差異，表明發(fā)酵液組、佳得樂(lè)和紅牛對(duì)體質(zhì)量無(wú)顯著影響（p＞0.05）。

2.2.2 對(duì)負(fù)重游泳力竭時(shí)間、BUN及LHD的影響

表4 發(fā)酵液、佳得樂(lè)和紅牛對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 4 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on exhausted time in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

表4 發(fā)酵液、佳得樂(lè)和紅牛對(duì)小鼠負(fù)重游泳時(shí)間、BUN和LHD的影響（±s,n=6）Table 4 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on exhausted time in swimming,BUN and LHD（±s,n=6）

由表4可以看出，對(duì)于各組小鼠的力竭游泳時(shí)間，t(紅牛組)＞t(發(fā)酵液組)＞t(空白組)＞t(佳得樂(lè))，與空白組和佳得樂(lè)組相比，發(fā)酵液組和紅牛組都具有極顯著性差異（p＜0.01），雖然發(fā)酵液組與紅牛組相比游泳時(shí)間更長(zhǎng)，但兩組之間并無(wú)顯著性差異。

通過(guò)BUN濃度的比較可以發(fā)現(xiàn)，C(發(fā)酵液組)＜C(佳得樂(lè))＜C(紅牛組)＜C(空白組)，與空白組相比，發(fā)酵液組、佳得樂(lè)組和紅牛組都具有顯著性差異（p＜0.05），但是該3組之間并無(wú)顯著性差異。綜上所述，灰樹(shù)花發(fā)酵液具有同佳得樂(lè)和紅牛相似的抗疲勞效果，但是該指標(biāo)結(jié)果不能證明發(fā)酵液比同類產(chǎn)品要更好。

此外，對(duì)于各組小鼠的LHD活力，U(發(fā)酵液組)＞U(佳得樂(lè))＞U(紅牛組)＞U(空白組)，即發(fā)酵液組的LDH活力均值最高，但各組之間無(wú)無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。究其原因，可能是組內(nèi)差異要大于組間差異，即組內(nèi)所測(cè)得的LDH活力差異性過(guò)大。造成這種現(xiàn)象的可能原因是在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于冬季氣溫較低，少數(shù)對(duì)溫度敏感的小鼠，提早出現(xiàn)疲勞和力竭狀態(tài)；而相對(duì)耐寒的小鼠則更容易適應(yīng)本次實(shí)驗(yàn)，這樣最終造成了組內(nèi)的差異遠(yuǎn)超過(guò)組間的差異，進(jìn)而無(wú)法通過(guò)方差分析得出組間的顯著性差異。

2.3 跑籠實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 對(duì)小鼠跑籠時(shí)間和速度的影響

表5 發(fā)酵液、佳得樂(lè)和紅牛對(duì)小鼠跑籠時(shí)間和速度的影響（±s,n=6）Table 5 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on time and speed of mice(±s,n=6)

表5 發(fā)酵液、佳得樂(lè)和紅牛對(duì)小鼠跑籠時(shí)間和速度的影響（±s,n=6）Table 5 Effect of broth,Gatorade and Red Bull on time and speed of mice(±s,n=6)

注：與空白組相比較，“*”表示p＜0.05。

由表5可以看出，對(duì)于跑籠事件t(發(fā)酵液組)＞t(佳得樂(lè)組)＞t(紅牛組)＞t(空白組)，即發(fā)酵液組小鼠在冷水中跑籠時(shí)間最長(zhǎng)。與空白組相比，發(fā)酵液組存在顯著性差異；但是與陽(yáng)性對(duì)照組（佳得樂(lè)和紅牛組）相比，則無(wú)顯著性差異。

通過(guò)對(duì)各組小鼠跑籠速度的分析可以看出，雖然V(發(fā)酵液組)＞V(佳得樂(lè)組)＞V(紅牛組)＞V(空白組)，但各組之間并無(wú)顯著性差異。這可能是由于組內(nèi)差異大于組間差異[14]所造成的，即組內(nèi)差異性遠(yuǎn)大于組間差異性，從進(jìn)而各組之間的差異不存在顯著性。

2.3.2 對(duì)小鼠每分鐘內(nèi)跑籠圈數(shù)的對(duì)比分析

表6 各組小鼠每分鐘內(nèi)跑籠圈數(shù)（圈）隨時(shí)間的變化Table 6 Change of the lap number per minute with time

由表6和附圖可知，發(fā)酵液組小鼠在整個(gè)跑籠過(guò)程中，跑籠時(shí)間最長(zhǎng)而且整體速度比其他3組更快，并且在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)速度峰值（第4min時(shí)達(dá)最大速度6.30r/min），這間接的反應(yīng)了實(shí)驗(yàn)組能小鼠能快速適應(yīng)強(qiáng)度較大的運(yùn)動(dòng)。而佳得樂(lè)組小鼠跑籠速度和紅牛組小鼠在整體水平上較為接近，跑籠時(shí)間也僅僅比紅牛組多1min。從總體趨勢(shì)來(lái)看，空白組和佳得樂(lè)組的跑籠速度上下波動(dòng)較大，可能是由于個(gè)體差異性太大引起的，個(gè)別小鼠能快速適應(yīng)低水溫，有的則不然。

圖1 各組小鼠每分鐘內(nèi)跑籠圈數(shù)隨時(shí)間的變化Fig.1 Change of the lap number per minute with time

3 結(jié)論

（1）與陽(yáng)性對(duì)照組相比較，灰樹(shù)花發(fā)酵液（濃縮至固形物含量為8%（w/w））具有相似的抗疲勞效果。

（2）與空白組相比較，灰樹(shù)花發(fā)酵液在提高體能，緩解疲勞方面具有顯著性的效果，具有開(kāi)發(fā)成為抗疲勞食品的潛力。

[1]韓省華，林勝龍，張東平.灰樹(shù)花在百山祖山區(qū)的發(fā)生及其規(guī)律[J].江蘇食用菌，1994，15（2）：35.

[2]王增池，孔德平，田曉亮.灰樹(shù)花的生態(tài)條件與藥用價(jià)值[J].中國(guó)食用菌，1998，17（6）：39-40.

[3]SUZUKI N,NISHIBORI K,OODAIRA Y,et al.Grifolisin，a member of the sedolisin family produced by the fungusGrifola frondosa[J].Phytochemistry,2005,66(9):983-990.

[4]OHNO N,SUZUKI I,OIKAWA S,et al.Antitumor activity and structural characterization of glucans extracted from cultured fruit bodies ofGrifola frondosa[J].Chem Pharm Bull,1984,32(6):1142-1151.

[5]候曉青，程桂芝.灰樹(shù)花多糖抗腫瘤小鼠S180 肉瘤的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥房，2007，18（3）：180-181.

[6]NANBA H,KODAMA N,SCHAR D,et al.Effect of Maitake (Grifola frondosa)glucan in HIV-infected patients[J].Mycoscience,2000,41(4):293-295.

[7]MASUDA Y,KODAMA N,NANBA H.Macrophage J774.1 cell is activated by MZ-Fraction (Klasma-MZ) polysaccharide inGrifola frondosa[J].Mycoscience,2006,47(6):360-366.

[8]袁德云，章克昌.灰樹(shù)花發(fā)酵液及其胞內(nèi)純化物的降血脂作用[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38（57）：507-508.

[9]KUBO K,AOKI H,NANBA H.Anti-diabetic activity present in the fruit body ofGrifola frondosa[J].Biol Pharm Bull,1994,17(8):1106-1110.

[10]KUBO K,NANBA H.Anti-hyperliposis effect of Maitake fruit body(Grifola frondosa)[J].Biol Pharm Bull,1997,20(7):781-785.

[11]林新堅(jiān)，鄭永標(biāo)，陳濟(jì)琛，等.靈芝發(fā)酵茶提取液對(duì)小鼠抗疲勞作用的研究[J].食用菌學(xué)報(bào)，2002，9（3）：18-21.

[12]郅 潔，李炳奇，廉宜君，等.沙棗多糖的提取及其抗氧化活性的研究[J].中成藥，2009，31（5）：796-798.

[13]HUANG LZ,HUANG BK,YE Q,et al.Bioactivity-guided fractionation for anti-fatigue fortune ofAcanthopanax senticosus[J].J Ethnopharmacol,2011,133(1):213-219.

[14]劉振學(xué)，黃仁和，田愛(ài)民.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.