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        原兒茶酸衍生物的合成及活性研究

        2013-04-22 02:28:40李取勝,王偉,韓秋俊,王鵬龍,李強,雷海民
        中國中藥雜志 2013年2期
        關(guān)鍵詞:原兒茶酸生物活性衍生物

        李取勝,王偉,韓秋俊,王鵬龍,李強,雷海民

        [摘要] 目的:探討原兒茶酸(protocatechuic acid,PCA)及其衍生物體外清除DPPH自由基活性及對雞胚絨毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane, CAM)血管新生的影響。方法:利用芐基保護及芐酯水解等相關(guān)反應(yīng),得到PCA系列衍生物PCA-1,PCA-2,PCA-3,結(jié)構(gòu)經(jīng)1H,13C-NMR及MS驗證,并采用DPPH自由基體外抗氧模型、CAM對PCA及其衍生物的活性進行篩選。 結(jié)果:PCA及含有鄰二酚羥基的PCA-1的體外清除DPPH自由基活性較強;PCA,PCA-3對新生血管有一定的抑制作用,而PCA-2則能促進血管的新生(P<0.001)。結(jié)論:PCA分子結(jié)構(gòu)中的鄰二酚羥基為體外清除DPPH自由基的活性部位;不含鄰二酚羥基,同時有羧基時能增強其促血管新生活性,但需要進一步的實驗驗證。

        [關(guān)鍵詞] 原兒茶酸;衍生物;DPPH自由基;雞胚絨毛尿囊膜;生物活性

        水溶性酚酸類成分原兒茶酸(protocatechuic acid,PCA)廣泛存在于老鸛草、丹參等常見中藥[1-2]以及復(fù)方丹參注射液、冠心寧注射液[3-4]等經(jīng)典復(fù)方制劑。不僅具有顯著降低心肌耗氧量,提高心肌耐氧能力,減慢心率[5]等藥理作用,而且大量文獻報道其具有確切的體外抗氧化活性[6-8],但并沒有通過實驗的方法尋找其抗氧化活性的位點的報道。本實驗采用芐基保護與芐酯水解的方法對PCA進行結(jié)構(gòu)修飾,并選取體外清除DPPH自由基模型及雞胚絨毛尿囊膜(chick chorioallantoic membrane, CAM)模型來研究PCA及其衍生物的體外抗氧化活性及對血管新生作用的影響,并探索PCA相關(guān)活性的活性位點。

        1 材料

        雙線恒溫加熱磁力攪拌器SH-3A(北京金紫光科技發(fā)展有限公司),RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠),分析天平(德國賽多利斯公司),LC-MS 2020(Shimadzu公司),Avance 500型核磁共振儀(F llanden, Switzerland),X-5顯微熔點測定儀(北京泰克儀器有限公司),酶標儀specta Max190(美國Molecular Devices),PH計(梅特勒-托利多儀器有限公司),96孔板(美國Costar公司),雞胚孵化箱(北京方通孵化器廠),顯微鏡(日本Olympus公司320040型),CJT型超凈工作臺(北京長城空氣凈化工程公司)。

        原兒茶酸(南京澤郎醫(yī)藥科技);氯化芐、Vit C(北京化工廠);DPPH、叔丁基對苯二酚(TBHQ, 阿拉丁試劑);二甲基亞砜(DMSO,Amresco公司);雞胚(北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司);吸附性明膠海綿(南京金陵制藥)。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 PCA衍生物的合成設(shè)計

        PCA結(jié)構(gòu)中含有鄰二酚羥基、羧基,要確定體外抗氧化活性位點,必須對其官能團進行選擇性保護。芐基保護常被用于有機合成反應(yīng)中,易與羧基、羥基選擇性結(jié)合,尤其在鄰二酚羥基保護中應(yīng)用較多[9-11],且芐基本身沒有其他官能團,故從實驗操作簡單角度選擇將PCA與溴化芐反應(yīng),分別得其衍生物PCA-1, PCA-2和PCA-3,主要設(shè)計路線及方法見圖1。

        2.2 PCA衍生物的合成

        2.2.1 化合物PCA-1的合成 取2.46 g PCA,溶解在20 mL干燥的二甲基甲酰胺(DMF)中,0.64 g氫氧化鈉溶于4 mL水并逐滴加入到DMF,混合液在冰浴下逐滴加入氯化芐1.85 mL,繼續(xù)攪拌20 min。室溫下攪拌20 h,升溫到50 ℃攪拌2 h。乙酸乙酯萃取3次,有機層依次水洗、飽和碳酸氫鈉洗、飽和氯化鈉洗,無水硫酸鎂干燥,過濾,回收乙酸乙酯得棕色固體,甲苯反復(fù)洗滌并干燥得到白色固體1.26 g,收率43%。mp 147~148 ℃。LC-MS m/z

        a. 氯化芐/氫氧化鈉/二甲基甲酰胺/水, 室溫20 h,50 ℃ 2 h; b. 氯化芐/碳酸鉀/二甲基甲酰胺, 85 ℃,過夜; c. 氫氧化鉀, 水-乙醇 1∶2 ,70 ℃,2 h。

        圖1 PCA衍生物的合成路線

        Fig.1 Synthesis of PCA derivants

        245.1 [M+H]+;1H-NMR(DMSO-d6,500 Hz)δ: 5.28(2H,s,1′-CH2-),6.83(1H,d,J=8.0 Hz,H-5),7.34~7.45(7H,m,Ar-H),9.40(1H,s,4-OH),9.81(1H,s,3-OH);13C-NMR(DMSO-d6,125 Hz)δ: 165.9(C-7),151.1(C-4),145.6(C-3),137.0(C-2′),129.0(C-4′,6′),128.5(C-5′),128.4(C-3′,7′),122.4(C-1),120.9(C-6),116.8(C-5),115.9(C-2),66.1(C-1′),與文獻[12]相當。

        2.2.2 化合物PCA-3的合成 取1 g PCA溶于20 mL干燥DMF中,攪拌下加入2.96 g干燥的碳酸鉀,室溫下逐滴加入2.98 mL氯化芐并持續(xù)攪拌10 min,之后在氮氣保護下85 ℃攪拌過夜。反應(yīng)結(jié)束冷卻至室溫,加100 mL水,用氯仿萃取3次(3×100 mL)。合并有機層,依次水洗、飽和氯化鈉洗,無水硫酸鈉干燥,過濾,回收氯仿得到油狀物。將油狀物通過硅膠柱,石油醚-丙酮(10∶1)為洗脫液,得到2.3 g白色固體,收率83.6%。mp 66~68 ℃;LC-MS m/z 425.2 [M+H]+;1H-NMR(CDCl3,500 Hz)δ: 5.23(2H,s,1″-CH2-),5.26(2H,s,1-CH2-),5.35(2H,s,1′-CH2-),6.95(1H,d,J=9.0 Hz,H-5),7.35~7.51(15H,m,Ar-H),7.70~7.71(2H,m,H-2,6);13C-NMR(CDCl3,125 Hz)δ: 166.1(C-7),153.0(C-4),148.3(C-3),136.8(C-2),136.5(C-2″),136.3(C-2′),128.7(C-4,6),128.6(C-4″,6″),128.5(C-4′,6′),128.2(C-5),128.1(C-5″),128.0(C-5′),127.9(C-3,7),127.4(C-3″,7″),127.2(C-3′,7′),124.1(C-1),123.0(C-6),115.5(C-2),113.2(C-5),71.2(C-1),70.8(C-1″),66.6(C-1′)。與文獻[13]一致。

        2.2.3 化合物PCA-2的合成 取1.5 g(3.53 mmol)化合物PCA-3于50 mL圓底燒瓶中,加入20 mL乙醇,取1 g(17.85 mmol)氫氧化鉀溶于10 mL水中,慢慢加入燒瓶,反應(yīng)液在70 ℃攪拌至反應(yīng)液呈均一狀態(tài)。蒸去反應(yīng)液中過量乙醇,加100 mL水,冷卻至室溫。逐滴加入4 mol·L-1鹽酸酸化至不再產(chǎn)生白色沉淀為止(pH 3~4),過濾,水洗,抽濾至干燥,得1.0 g白色固體,收率84.8%。mp 187~188 ℃;LC-MS m/z 335.2 [M+H]+;1H-NMR(DMSO-d6,500 Hz)δ: 5.18(2H,s,1″-CH2-),5.23(2H,s,1′-CH2-),7.16(1H,d,J=9.0Hz,H-5),7.31~7.47(10H,m,Ar-H),7.56~7.53(2H,m,H-2,6),12.3(1H,br s,-COOH);13C-NMR(DMSO-d6,125 Hz)δ: 167.5(C-7),152.5(C-4),148.0(C-3),137.5(C-2″),137.2(C-2′),129.0(C-4″,6″),128.9(C-4′,6′),128.4(C-5″),128.3(C-5′),128.0(C-3″,7″),127.9(C-3′,7′),124.0(C-6),123.7(C-1),115.0(C-2),113.5(C-5),70.4(C-1″),70.3(C-1′)。與文獻[13-14]相當。

        2.3 活性篩選

        2.3.1 體外清除DPPH自由基活性篩選[15-18] 于DMSO中將Vit C,TBHQ,PCA及其衍生物PCA-1,PCA-2和PCA-3配制成質(zhì)量濃度為10.0 g·L-1的溶液,其中Vit C,TBHQ為陽性對照藥物;通過DPPH自由基清除實驗對上述化合物進行篩選,以確定PCA體外抗氧化活性的作用位點。

        在96孔板中,每個樣品重復(fù)3次,待樣品和95%乙醇全部加完后,再加入0.1 mmol·L-1 DPPH的95%乙醇溶液,室溫下避光反應(yīng)20 min,在517 nm處測定吸光度A;DPPH自由基清除率=[1-(As-A0)/Ac] ×100%。其中,樣品組(As):20 μL樣品+180 μL DPPH自由基溶液;對照組(Ac):20 μL DMSO +180 μL DPPH自由基溶液;空白組(A0):20 μL樣品+180 μL 95%乙醇。

        2.3.2 對CAM模型的作用 參照文獻[19-20],在無菌環(huán)境下給藥組加入PCA,PCA-1,PCA-2和PCA-3,給藥劑量為30 μg/雞胚;空白組加生理鹽水。采用Image-Pro Plus5.0軟件計數(shù)由載體輻射新生血管(直徑<100 μm)數(shù)目。

        2.4 結(jié)果

        2.4.1 清除DPPH自由基活性結(jié)果 當樣品在反應(yīng)體系中質(zhì)量濃度為1 g·L-1時,以Vit C,TBHQ為陽性對照,PCA及其衍生物對DPPH自由基清除率見表1。

        2.4.2 CAM模型篩選結(jié)果 加藥72 h后在解剖顯微鏡下觀察給藥組與空白組的CAM新生血管生長情況,發(fā)現(xiàn)給藥組PCA-2中新生毛細血管從載體邊緣輻射狀發(fā)出,其數(shù)目與空白組相比有所增多,其他幾組則不顯著。說明衍生物PCA-2對CAM新生血管有顯著性促進作用,見表2。

        3 討論及結(jié)論

        在PCA衍生物的合成過程中,均是參照文獻的操作來進行,但是PCA-1的產(chǎn)率(43%)與文獻[12]較高的產(chǎn)率(>80%)有較大差距,分析原因是堿水加入的速度對反應(yīng)的影響較大,速度越快,酚羥基也會被活化,副產(chǎn)物就會增多,所以加入堿水速度較慢時能提高反應(yīng)產(chǎn)率。同時,可考慮采用較弱的堿,如碳酸氫鈉、碳酸鉀等。PCA-3的合成也可采用溴化芐,其反應(yīng)速率在常溫時就比較快,但其相對氯化芐價格較貴。故采用氯化芐時,為提高反應(yīng)速率可提高溫度或者在反應(yīng)液中加入碘化鉀。PCA-2由PCA-3水解得到,屬常規(guī)反應(yīng)。

        抗氧化實驗結(jié)果得出在體系質(zhì)量濃度為1 g·L-1時,比較PCA,PCA-1,PCA-2,PCA-3對DPPH自由基清除作用, 初步驗證了PCA體外清除DPPH自由基的活性位點為分子中鄰二酚羥基。

        對于血管新生實驗,在藥物濃度為30 μg/雞胚時,PCA與PCA-3對血管新生有一定的抑制作用,但相對于空白組P>0.05(PCA: P=0.373;PCA-1: P=0.593;PCA-3: P= 0.063),組間差別不大。而PCA-2的新生血管數(shù)目為10.75±3.19,相對空白組P<0.001,說明衍生物PCA-2能促進血管的新生。比較上述衍生物的結(jié)構(gòu),可推測在PCA結(jié)構(gòu)中不含鄰二酚羥基,同時存在羧基時有促血管新生活性,但這需要進一步驗證。

        本實驗采用芐基保護的方法,對PCA的不同位點進行修飾,得其衍生物,該合成方法成熟,易操作。并采用DPPH自由基體外抗氧模型、CAM模型對PCA及其衍生物的活性進行篩選,為酚酸類或具有類似結(jié)構(gòu)的化合物的結(jié)構(gòu)修飾與相關(guān)活性研究提供了一定的參考。

        [參考文獻]

        [1] 張善玉,姜艷玲,樸惠順,等. HPLC測定老鸛草中的原兒茶酸[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2007, 22(4): 453.

        [2] 芮建中,鄒漢法,袁倚盛,等. 毛細管電泳法分離丹參水溶性有效成分——丹參素、原兒茶醛和原兒茶酸[J].中草藥,2000, 31(5): 337.

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