劉 暢，巴曉紅，閔連秋，劉學(xué)文

炎癥機(jī)制是腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制。炎性細(xì)胞在腦缺血過(guò)程中的激活和炎性遞質(zhì)的釋放在腦缺血損傷中占有重要的地位。因此，有效抑制炎性細(xì)胞激活及炎性遞質(zhì)釋放，從而阻斷炎性損傷是控制缺血性腦損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本課題組前期研究表明，頭孢曲松具有抑制腦缺血后大鼠腦組織核因子κB (NF-κB)表達(dá)的作用，從而起到了神經(jīng)保護(hù)作用[1]。而NF-κB不但參與炎性反應(yīng)，其激活更與白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)等炎性遞質(zhì)的表達(dá)密切相關(guān)。本研究通過(guò)制備大鼠局灶性腦缺血模型，研究頭孢曲松鈉對(duì)缺血周?chē)X組織白介素1β(IL-1β)和IL-6表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討其抑制腦缺血損傷的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量280～320 g(由遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，許可證號(hào)：SCXK(遼)2003-1007。應(yīng)用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、預(yù)處理組，每組8只。

1.2 方法

1.2.1 給藥方法 預(yù)處理組大鼠每日腹腔注射頭孢曲松鈉(上海新先鋒藥業(yè)有限公司提供，規(guī)格1.0 g，批號(hào)080560)200 mg/kg，共5 d。假手術(shù)組和模型組大鼠分別給予等量的0.9%氯化鈉注射液腹腔注射，給藥方法及療程同預(yù)處理組。

1.2.2 大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)動(dòng)物模型制備 參照文獻(xiàn)[2]，各組大鼠MCAO術(shù)前12 h禁食，以防手術(shù)時(shí)誤吸，不禁水。以10%水合氯醛3 ml/kg行腹腔麻醉，沿頸部正中行2～3 cm切口，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈、頸內(nèi)動(dòng)脈及翼腭動(dòng)脈。結(jié)扎頸總動(dòng)脈近心端及翼腭動(dòng)脈，在頸總動(dòng)脈分叉處結(jié)扎頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端。于頸內(nèi)動(dòng)脈近心端置動(dòng)脈夾夾閉，距頸總動(dòng)脈分叉處近心端0.5 cm處將頸總動(dòng)脈剪一小口，插入備好的尼龍線栓，去除動(dòng)脈夾，沿頸內(nèi)動(dòng)脈輕輕向前推進(jìn)至大腦前動(dòng)脈(深18 mm左右)，結(jié)扎頸內(nèi)動(dòng)脈并固定線栓。假手術(shù)組大鼠術(shù)中不插入線栓，其余過(guò)程與上述相同。MCAO模型制備成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)為大鼠即刻出現(xiàn)同側(cè)Horner征。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 神經(jīng)功能評(píng)分 參考文獻(xiàn)[3]的方法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分：(1)0分，無(wú)神經(jīng)缺損癥狀；(2)1分，輕微神經(jīng)缺損癥狀，不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；(3)2分，中度局灶性神經(jīng)缺損癥狀，爬行時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；(4)3分，重度局灶性神經(jīng)缺損癥狀，行走時(shí)向?qū)?cè)傾斜；(5)4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)改變。于大鼠MCAO術(shù)后約2 h清醒至24 h內(nèi)進(jìn)行3次神經(jīng)功能評(píng)分，取平均值。

1.3.2 大腦皮質(zhì)IL-1β和IL-6陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞數(shù) MCAO術(shù)后24 h，用水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后，于頸正中偏右切開(kāi)，以4%多聚甲醛約50 ml局部灌流內(nèi)固定后，斷頭取腦。乙醇脫水，石蠟包埋，制成約5 μm厚的連續(xù)切片。將其進(jìn)行免疫組化SABC法染色：脫蠟水化；熱修復(fù)；山羊血清封閉；滴加一抗(1∶100)、二抗；滴加試劑SABC；DAB顯色；蘇木素復(fù)染；脫水、透明及封片。于每張切片右側(cè)頂葉皮質(zhì)和海馬CA1區(qū)各取5個(gè)高倍鏡視野(10×40)，陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色(IL-1β及IL-6均為細(xì)胞質(zhì)染色)，按照陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù))×100%計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)率。IL-1β和IL-6試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

2 結(jié)果

2.1 頭孢曲松鈉預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 MCAO術(shù)后，3組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組、預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分與假手術(shù)組比較，預(yù)處理組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。

2.2 頭孢曲松鈉預(yù)處理對(duì)大鼠腦缺血周?chē)M織中IL-1β、IL-6表達(dá)的影響 光學(xué)顯微鏡下發(fā)現(xiàn)：假手術(shù)組大鼠腦缺血周?chē)M織可見(jiàn)少量IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞；模型組大鼠IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞較則明顯增加；而預(yù)處理組大鼠IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞較模型組則明顯減少(見(jiàn)圖1)。假手術(shù)組大鼠腦缺血周?chē)M織可見(jiàn)少量IL-6陽(yáng)性細(xì)胞；模型組大鼠IL-6陽(yáng)性細(xì)胞增多，主要分布于缺血半暗帶皮質(zhì)和海馬組織；而預(yù)處理組大鼠IL-6陽(yáng)性細(xì)胞較模型組則明顯減少(見(jiàn)圖2)。

統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)結(jié)果顯示，3組大鼠腦缺血周?chē)M織中IL-1β、IL-6陽(yáng)性表達(dá)率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組、預(yù)處理組大鼠IL-1β、IL-6陽(yáng)性表達(dá)率與假手術(shù)組比較，預(yù)處理組大鼠IL-1β、IL-6陽(yáng)性表達(dá)率與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)表1)。

3 討論

在腦缺血后數(shù)小時(shí)到數(shù)天都可以觀察到顯著的白細(xì)胞浸潤(rùn)，其數(shù)量與腦梗死容積直接相關(guān)[4]。腦缺血時(shí)，血流速度減慢使中性粒細(xì)胞更易黏附于血管內(nèi)皮細(xì)胞，啟動(dòng)炎性反應(yīng)[5]，同時(shí)引起氧自由基等物質(zhì)釋放，加重組織水腫。研究表明，抑制中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)可以降低缺血再灌注損傷和改善預(yù)后[6]。在大鼠腦缺血模型中，應(yīng)用中性粒細(xì)胞抑制因子可發(fā)揮明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和腦梗死容積[7]。

有研究發(fā)現(xiàn)，在缺血再灌注損傷后，炎性遞質(zhì)大量表達(dá)，如IL-1β、IL-6、白介素8(IL-8)、白介素10(IL-10)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白等，這些炎性遞質(zhì)的表達(dá)與腦組織損傷預(yù)后密切相關(guān)[7-8]。白介素在腦缺血性損傷中扮演著重要的角色。其中IL-1β對(duì)組織損傷至關(guān)重要。IL-1β是 IL-1家族成員之一，能夠誘導(dǎo)炎性反應(yīng)，激活內(nèi)皮細(xì)胞的活化，增加一氧化氮、谷氨酸和過(guò)氧化物的釋放，介導(dǎo)腦組織的損傷[9]。IL-1β的 mRNA已經(jīng)被證實(shí)在大腦皮質(zhì)、紋狀體、海馬、丘腦等部位表達(dá)，并在大腦缺血后迅速激活并持續(xù)分泌，直到第7天[10]。相關(guān)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確認(rèn)外源性 IL-1β可以引起缺血性腦損傷的惡化，而在對(duì)小鼠行MCAO后，缺乏IL-1β的小鼠與野生型小鼠比較，明顯具有更小的腦梗死體積。在 MCAO術(shù)后急性期抑制IL-1β的表達(dá)，可以使腦梗死體積明顯減少[11]。本研究結(jié)果顯示，在 MCAO術(shù)后24 h，頭孢曲松鈉預(yù)處理的大鼠腦缺血周?chē)M織中IL-1β的陽(yáng)性表達(dá)率較MCAO模型大鼠明顯下降，提示頭孢曲松鈉可以顯著降低大鼠缺血腦組織中IL-1β的表達(dá)水平，抑制炎癥的發(fā)生，可能是其神經(jīng)元保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

Table1 Comparison of neurological scores and positive expression rate of IL-1β and IL-6 around ischemic tissue in the three groups

組別只數(shù)神經(jīng)功能評(píng)分(分)IL-1β(%)IL-6(%)假手術(shù)組80 7.3±1.3 6.8±2.6 模型組82.5±0.9* 82.7±12.4* 69.3±10.2* 預(yù)處理組81.5±0.8*△52.7±9.9*△50.4±9.8*△F值44.33353.27179.64P值0.000.000.00

注：IL-1β=白介素1β，IL-6=白介素6；與假手術(shù)組比較，*P<0.01；與模型組比較，△P<0.01

圖1 3組大鼠局灶性腦缺血周?chē)M織中IL-1β的表達(dá)(SABC，×200)

Figure1 Expression of IL-1β around focal cerebral ischemia tissue in the three groups

圖2 3組大鼠局灶性腦缺血周?chē)M織中IL-6的表達(dá)(SABC，×400)

Figure2 Expression of IL-6 around focal cerebral ischemia tissue in the three groups

IL-6在腦缺血急性期是重要的炎性遞質(zhì)，可導(dǎo)致腦炎性損傷[12]；且外周血中的IL-6水平是反映腦缺血損傷早期的敏感性指標(biāo)。有研究顯示，MCAO模型中IL-6在外周血2 h即開(kāi)始上升，早于腦組織開(kāi)始上升時(shí)間(24 h)[13]。已經(jīng)有研究表明，缺血再灌注損傷發(fā)生后，腦內(nèi)IL-6的水平上升，IL-6 mRNA在局灶性腦梗死后同樣表達(dá)上調(diào)。IL-6 的快速表達(dá)在時(shí)間上與其他炎性遞質(zhì)相似，在缺血后6 h已經(jīng)有明顯上升，并考慮與腦梗死容積有一定相關(guān)性[14]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠皮質(zhì)僅有基礎(chǔ)水平的IL-6表達(dá)，而MCAO模型大鼠IL-6陽(yáng)性表達(dá)率則顯著增加，提示IL-6參與了腦缺血損傷過(guò)程。與MCAO模型大鼠比較，頭孢曲松鈉預(yù)處理大鼠腦缺血周?chē)M織中IL-6陽(yáng)性表達(dá)率顯著降低，提示頭孢曲松鈉可以抑制腦缺血后IL-6的表達(dá)。

總之，本研究結(jié)果提示IL-1β、IL-6均參與了缺血性腦損傷的病理生理過(guò)程，而頭孢曲松鈉具有抑制腦缺血后大鼠腦組織IL-1β、IL-6表達(dá)的作用，通過(guò)抑制損傷后炎性反應(yīng)來(lái)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

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