段哲萍，于新江，劉媛媛

當前，肺癌的發(fā)病率及死亡率均已高居各類惡性腫瘤之首，且逐年增高，對人類健康造成嚴重威脅，腫瘤的高轉移率和腫瘤細胞的耐藥性為其致死的最重要原因，通過何種途徑提高療效、減輕放化療毒副作用、降低腫瘤的復發(fā)和轉移已成為肺癌治療的重中之重[1-2]。大量研究表明，腫瘤細胞的增殖及轉移同瘤體內(nèi)新生血管高度相關，所以抑制瘤體內(nèi)新生血管生成、切斷腫瘤血液的供應，能夠抑制腫瘤生長和血行轉移[3]。已有研究證明復方苦參注射液可抑制腫瘤的生長與轉移，進而改善臨床癥狀，配合放化療應用具有顯著的減毒增效作用[4]。本實驗檢測復方苦參注射液聯(lián)合放射治療對小鼠肺癌Lewis細胞株的腫瘤血管新生及腫瘤細胞增殖、轉移的抑制作用，為中藥聯(lián)合放射治療肺癌提供確實的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 小鼠肺癌Lewis細胞株，由河北醫(yī)科大學免疫教研室饋贈，用于建立小鼠腫瘤模型。

1.1.2 實驗動物 6周齡左右、健康SPF級、雄性C57BL/6小鼠60只，體質量20～25 g，來自于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，清潔級環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑 細胞培養(yǎng)基：DMEM(批號：cat NO 12800-017,lot NO 1164642)、RPMI-1640(批號：cat NO 31800-022,lot NO 688600)、胎牛血清 (優(yōu)級，批號：130624),購于GIBICO BRL公司。培養(yǎng)基加用丁胺卡那霉素為華北制藥股份有限公司產(chǎn)品。復方苦參注射液購自山西振東制藥有限公司。

1.1.4 主要儀器設備 瑞典醫(yī)科達公司精確治療系統(tǒng)全數(shù)字化直線加速器；日本東芝放射治療模擬定位機；英國ADAC計算機三維適形放射治療計劃系統(tǒng)；二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱：SANYO；恒溫水浴箱:PolyScience or HAAKE DC3；高速離心機5417R，Eppendorf公司，德國；普通高速離心機5415D：Eppendorf公司，德國；微量振蕩器MH-1：江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司。超凈工作臺：吳江市凈化設備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 肺癌Lewis細胞株快速復蘇后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于恒溫培養(yǎng)箱中(37 ℃，5%CO2)培養(yǎng)。每日在倒置顯微鏡下觀察，2～3 d更換培養(yǎng)液傳代。

1.2.2 動物模型的制作 取對數(shù)生長期肺癌Lewis細胞株，以0.25%胰酶消化，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將腫瘤細胞自培養(yǎng)瓶壁刮下，移至離心管，2 000 r/min，離心10 min，離心半徑13.5 cm，棄上清液，加入PBS，重復離心2次，洗去血清，臺盼藍染色，PBS調細胞濃度至1×107個/ml。C57BL/6小鼠60只，1 ml注射器將0.1 ml腫瘤細胞懸液接種于右側腋窩皮下。觀察腫瘤生長進程1次/3 d，12 d左右皮下可觸及腫物，直徑5～7 mm，成瘤率90%以上。

1.2.3 分組 選取腫瘤結節(jié)形狀規(guī)則、與肌肉皮膚無明顯粘連的小鼠40只用于實驗，采用隨機數(shù)字表法分為4組：對照組、復方苦參注射液組、單純放療組和聯(lián)合治療組，每組各10只。對照組：0.9%氯化鈉溶液3 ml/kg腹腔注射，第12～16天，1次/d，共5次。模擬放射治療，第12、14、16、18天，0 Gy/次，共4次。復方苦參注射液組：復方苦參注射液3 ml/kg腹腔注射，第12～16天，1次/d，共5次。模擬放射治療，第12、14、16、18天，0 Gy/次，共4次。單純放療組：0.9%氯化鈉溶液3 ml/kg腹腔注射，第12～16天，1次/d，共5次。采用6 MV-X線放射治療，第12、14、16、18天，5 Gy/次，共4次。聯(lián)合治療組：復方苦參注射液3 ml/kg腹腔注射，第12～16天，1次/d，共5次，同時采用6 MV-X線放射治療，第12、14、16、18天，5 Gy/次，共4次。

1.2.4 指標檢測 (1)治療開始后每3 d用游標卡尺測量各組小鼠腫瘤長徑(a)及短徑(b)，計算腫瘤平均體積，觀察記錄腫瘤結節(jié)的外觀、質地、活動度等生長情況。腫瘤體積計算公式：腫瘤體積(mm3)=a×b2/2。(2)腫瘤抑制率=1-實驗組體積/對照組體積。(3)第27天處死各組小鼠取標本，取腫瘤組織、肺組織稱重，再迅速以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，組織切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，免疫組化檢測。

取小鼠腫瘤組織及肺組織以10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切片，以3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化酶活性，微波修復，加入兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)抗體/兔抗人CD34抗體，4 ℃過夜，工作濃度分別為1∶50和1∶1 000，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，以黃色、棕色、棕褐色為陽性表達。VEGF陽性細胞比例評分以陽性細胞百分比≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～80%為3分，>80%為4分；染色強度評分以細胞無著色為0分，胞質、核膜黃色為1分，胞質、核膜棕黃色為2分，胞質、核膜棕褐色為3分。陽性細胞比例評分與染色強度評分之和即為VEGF免疫組化評分，隨機檢查5個高倍視野，計算VEGF免疫組化評分，取其平均值。

在顯微鏡(×100倍)低倍視野下找尋微血管稠密區(qū)域，再在(×400倍)高倍視野下行微血管計數(shù)，取平均值計為微血管密度(MVD)。微血管判斷標準：血管內(nèi)皮細胞簇棕色或單個內(nèi)皮細胞與比鄰微血管、腫瘤細胞及其他結締組織分開，計為1個微血管。

1.2.5 放射治療方法 先將小鼠進行麻醉(10%氯胺酮200 mg/kg腹腔注射)，麻醉成功后固定于解剖板，使腫塊局部充分暴露，模擬機定位，腫瘤徹底包括于射野下，偏轉機頭15°～20°避免照射正常肺組織，采用高能X射線(能量6 MV)，使用1.0～2.0 cm限光筒。對照組及復方苦參組輸出劑量率為0 Gy/min，單純放療組及聯(lián)合治療組輸出劑量率為2.4 Gy/min。

2 結果

2.1 不同組腫瘤體積比較 C57BL/6小鼠接種0.1 ml 1×107個/ml肺癌腫瘤細胞建立動物模型，待接種后12 d腫瘤增至5～7 mm時開始進行治療，結果顯示，接種后12、15 d對照組、復方苦參組、單純放療組及聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；接種后18、21、24、27 d復方苦參組、單純放療組、聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積較對照組均減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；接種后18、21、24、27 d聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積較復方苦參組和單純放療組均減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；接種后21、24、27 d單純放療組小鼠腫瘤體積較復方苦參組均減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.2 不同組腫瘤數(shù)量、腫瘤質量及腫瘤抑制率比較 復方苦參組、單純放療組和聯(lián)合治療組小鼠較對照組肺內(nèi)腫瘤數(shù)量和腫瘤質量均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；單純放療組和聯(lián)合治療組較復方苦參組腫瘤數(shù)量和腫瘤質量均降低，腫瘤抑制率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；聯(lián)合治療組較單純放療組腫瘤質量降低，腫瘤抑制率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2)。

2.3 VEGF免疫組化評分比較 VEGF免疫組化結果以黃棕色為陽性著色，位于腫瘤細胞的胞質及新生毛細胞血管內(nèi)皮細胞。4組VEGF免疫組化評分比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；復方苦參組、單純放療組和聯(lián)合治療組較對照組均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

2.4 MVD比較 4組MVD比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中復方苦參組、單純放療組和聯(lián)合治療組較對照組均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表3)。

表2 不同組腫瘤數(shù)量、腫瘤質量及腫瘤抑制率比較

Table2 Comparison of number,weight,and inhibition rate of tumor among groups

組別例數(shù)腫瘤數(shù)量(個)腫瘤質量(g)腫瘤抑制率(%)對照組105.24±1.44 3.45±1.20 -復方苦參組104.19±1.35* 2.68±1.04* 24.97 單純放療組102.85±1.26*△2.16±0.99*△ 35.32△ 聯(lián)合治療組102.40±1.44*△1.32±0.75*△▲56.53△▲F(χ2)值8.84910.26021.087☆P值0.007 0.003 0.000

注：與對照組比較，*P<0.05；與復方苦參組比較，△P<0.05；與單純放療組比較，▲P<0.05；☆為χ2值；-為無此項

Table3 Comparison of VEGF immunohistochemistry score and MVD among groups

組別例數(shù)VEGF免疫組化評分(分)MVD(個)對照組105.038±0.645 42.73±12.56 復方苦參組103.562±0.112*32.81±9.04*單純放療組104.257±0.300*29.55±7.11*聯(lián)合治療組102.895±0.073*17.42±4.26*F值21.8634.508P值 0.000 0.039

注：VEGF=血管內(nèi)皮生長因子，MVD=微血管密度；與對照組比較，*P<0.05

表1 不同組腫瘤體積比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與聯(lián)合治療組比較，▲P<0.05；與復方苦參組比較，△P<0.05

3 討論

放射治療已經(jīng)歷了一個多世紀的發(fā)展歷史，在倫琴發(fā)現(xiàn)X線、居里夫婦發(fā)現(xiàn)鐳之后，很快就分別用于臨床治療惡性腫瘤，直到目前放射治療仍是惡性腫瘤重要的局部治療方法。放射治療發(fā)展較快，超高壓治療機的使用、輔助工具的改進和經(jīng)驗的積累，使放射治療的效果得到顯著提高，目前已成為惡性腫瘤治療中的最重要手段之一。不過，由于某些惡性腫瘤對放射線敏感性低，同時放射治療難以抑制遠處轉移，致使治療失敗。目前，惡性腫瘤主要的治療模式是放射治療、化學療法綜合治療，但由于毒副作用過大，常無法順利完成治療。如何提高放射治療的療效，提高惡性腫瘤局部控制率，降低轉移率，與此同時最大限度減少對正常組織的破壞，是當前腫瘤學工作者亟待解決的問題。

復方苦參注射液主要成分包括苦參、白土茯苓，具有清熱解毒、除濕涼血、散結止痛的功效。近年研究發(fā)現(xiàn)，復方苦參注射液有誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤生長和轉移，提高機體免疫力，減輕癌痛、腫瘤熱以及減輕化療引起的胃腸道反應等作用，進一步研究顯示，復方苦參注射液對于胃癌組織中新生血管內(nèi)皮細胞增殖具有抑制作用[5-6]。

本實驗采用肺癌Lewis細胞株建立動物模型，接種12 d后腫瘤增至5～7 mm時開始進行治療，結果顯示，接種后12、15 d對照組、復方苦參組、單純放療組及聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積無差異；接種后18、21、24、27 d復方苦參組、單純放療組、聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積較對照組均減小，說明無論是放射治療還是復方苦參注射液對腫瘤細胞的生長均有抑制作用；接種后18、21、24、27 d聯(lián)合治療組小鼠腫瘤體積較復方苦參組和單純放療組均減小，說明聯(lián)合治療的抑瘤效果更好。接下來不同組腫瘤數(shù)量、腫瘤質量及腫瘤抑制率比較中，復方苦參組、單純放射療組和聯(lián)合治療組小鼠肺內(nèi)腫瘤數(shù)量和腫瘤質量均降低；與單純放療組、復方苦參組比較，聯(lián)合治療組腫瘤質量降低，腫瘤抑制率升高，也同樣證實中藥聯(lián)合放射治療腫瘤效果優(yōu)于單純放射治療及中藥治療。

有研究表明當腫瘤體積小于2 mm3時，腫瘤細胞營養(yǎng)供給和代謝產(chǎn)物排泄主要依賴于周圍組織的彌散作用，而當腫瘤體積大于2 mm3時，則必須由新生血管來提供營養(yǎng)，此時腫瘤體積常會迅速增大，大量腫瘤細胞釋放易于發(fā)生血行轉移。本實驗探討了復方苦參注射液聯(lián)合放射治療對于肺癌Lewis細胞株荷瘤小鼠移植瘤生長和血管生成的抑制作用，結果復方苦參注射液單獨或聯(lián)合放射治療均表現(xiàn)出良好的腫瘤抑制作用，與對照組相比，移植瘤生長減慢、體積縮小、質量減輕、腫瘤轉移能力降低，其中單純放療組效果優(yōu)于復方苦參組，而聯(lián)合治療組抑瘤率更是達到56.53%，高于單獨使用(單純放療組35.32%，復方苦參組24.97%)。

VEGF是血管內(nèi)皮細胞特異性的肝素結合生長因子，可在體內(nèi)誘導新生血管，為已知最主要的誘導血管新生的因子，可與血管內(nèi)皮細胞表面受體特異性結合，從而促進血管內(nèi)皮細胞增殖、分裂及遷移，對血管新生起關鍵作用，并且VEGF還可提高血管通透性，有助于腫瘤細胞通過血管壁進入血循環(huán)，進而向其他器官轉移。MVD在一定程度上反映惡性腫瘤血管生成程度，與惡性腫瘤增殖、轉移能力呈正比，是判斷非小細胞肺癌預后的主要指標之一。所以，抑制腫瘤組織中的VEGF表達可有效抑制血管新生，延緩腫瘤轉移[7-9]。本研究采用免疫組化法檢測腫瘤組織中VEGF及MVD，結果顯示對照組VEGF免疫組化評分和MVD最高，復方苦參注射液及放射治療均可降低肺癌組織中VEGF的表達和MVD，而兩者聯(lián)合應用則表現(xiàn)出更強的抗新生血管作用。

綜上所述，復方苦參注射液聯(lián)合放射治療可通過下調VEGF表達，抑制腫瘤中微血管生成，發(fā)揮抗腫瘤細胞增殖和轉移的協(xié)同作用，值得進一步在臨床推廣應用。

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