韓 明,韓燕燕,劉仕成

病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)是兒科臨床常見的心血管疾病，其發(fā)病有上升趨勢，VMC可伴有心功能障礙或嚴(yán)重心律失常，并且已成為青少年不明原因猝死的主要原因之一，不僅如此，慢性VMC還可導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病的發(fā)生，嚴(yán)重危害小兒生命健康。因VMC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，至今國內(nèi)外對VMC尚無特效的治療方法。12-脂加氧酶(12-LO)是一類以非血紅素鐵蛋白為輔基的多功能酶，屬于脂質(zhì)酶家族中的一種，廣泛分布于機(jī)體各部分，具有多種生物功能[1]。12-LO也是一種重要的信號分子，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，通過機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，參與了高血壓、動脈粥樣硬化等多種疾病的病理過程[2]。本研究旨在探討12-LO抑制劑黃芩素對小鼠VMC發(fā)病的影響，為黃芩素治療VMC的可行性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立[3]及實(shí)驗(yàn)分組 選取4周齡純種近系BALB/C雄性小鼠250只，飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境中，體質(zhì)量(16±1) g，狀態(tài)良好，活躍，飲食正常，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)前稱量小鼠的體質(zhì)量并做記錄，采用計(jì)算機(jī)隨機(jī)分組的程序隨機(jī)分成5組，每組50只。A 組：正常小鼠空白對照組，不給予病毒，每只小鼠腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.1 ml；B組：模型組，每只小鼠腹腔注射10-2TCID50柯薩奇B3病毒(CVB3)0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.9%氯化鈉溶液0.1 ml；C組：高劑量治療組，每只小鼠腹腔注射CVB3 0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.4 g/L黃芩素溶液0.5 ml；D組：中劑量治療組，每只小鼠腹腔注射CVB3 0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.2 g/L黃芩素溶液0.5 ml；E組：低劑量治療組，每只小鼠腹腔注射CVB3 0.1 ml，在腹腔注射病毒后2 h，每只腹腔注射0.1 g/L黃芩素溶液0.5 ml。以上小鼠腹腔注射CVB3共3 d，藥物治療連續(xù)21 d。分別于第4、7、14、21天隨機(jī)取部分小鼠待用。

1.2 各組小鼠一般情況 A組50只小鼠未出現(xiàn)任何癥狀，無一例死亡。B組小鼠在接種病毒后第3天出現(xiàn)毛發(fā)松散、粗糙灰暗，不思飲食，稀便，行動遲緩，對刺激反應(yīng)減退等癥狀，第4天有死亡，第7～14天是死亡的高峰，第14天后癥狀減輕。50只小鼠中有45只感染VMC，發(fā)病率為90%；21 d內(nèi)共死亡14只，死亡率為28%。C、D、E組分別有44、47、46只小鼠感染VMC，發(fā)病率分別為88%、94%、92%。C組小鼠從病毒接種后21 d內(nèi)共死亡1只，死亡率為2%。D組小鼠從病毒接種后21 d內(nèi)共死亡6只，死亡率為12%。E組小鼠從病毒接種后21 d內(nèi)共死亡8只，死亡率為16%。

1.3 心肌組織病理學(xué)檢查 各組小鼠均于第4、7、14、21天隨機(jī)抽取小鼠8只，拉頸脫臼處死。取小鼠心臟組織用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察心肌組織的病理變化；并根據(jù)Rezkalla半定量分析法[4]計(jì)算心肌病變積分：即每張切片隨機(jī)取5個高倍鏡視野,計(jì)算炎性細(xì)胞浸潤、心肌壞死面積占整個切片心肌面積的百分比。病理積分標(biāo)準(zhǔn)：無炎性細(xì)胞浸潤、心肌壞死計(jì)0分，炎性細(xì)胞浸潤、心肌壞死<25% 計(jì)1分，25%～50% 計(jì)2分，51%～75% 計(jì)3分，>75%計(jì)4分。

1.4 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法檢測心肌組織中12 - LO mRNA的表達(dá)情況 按照RT-PCR一步法試劑盒說明書進(jìn)行操作(RT-PCR試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司)。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性120 s，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s， 循環(huán)35次，最后72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以DL-2000 作相對分子質(zhì)量對照，同時各組均擴(kuò)增β-actin作為內(nèi)對照。引物序列：12-LO mRNA上游5′-ACTCCCATTGAGCCTAAA-3′，下游5′-GGAGCAACACCTTGGAAA-3′；內(nèi)對照β-actin上游5′-CGTTGACATCCGTAAAGACAGG-3′，下游5′-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3′。擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別為12-LO mRNA 450 bp，β-actin 201 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物序列測序通過GenBank獲得(通過primer 5.0設(shè)計(jì)，由大連寶生物有限公司合成)，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行半定量分析，用美國Pharmacia biotech公司凝膠成像分析系統(tǒng)掃描測定PCR產(chǎn)物電泳條帶密度，按下列公式計(jì)算12-LO mRNA相對表達(dá)量，12-LO mRNA相對表達(dá)量=12-LO mRNA電泳條帶密度/β-actin電泳條帶密度。

1.5 血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平檢測 小鼠眼眶采血，分離血清，應(yīng)用Beckman-Coulter ACCESS微粒子全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測 CVB3感染后的BALB/C小鼠血清CK-MB水平。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心肌組織病理積分 5組小鼠各時間段的心肌組織病理積分比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中B組小鼠各時間段心肌組織病理積分均高于A 組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；C、D、E組小鼠各時間段心肌組織病理積分均低于B組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table1 Comparison of myocardial tissue pathological score of mice in five groups at different time

組別只數(shù)第4天第7天第14天第21天A組80000B組8120±033▲303±046▲277±072▲110±049▲C組8077±023△154±061△089±056△043±031△D組8090±028△183±063△107±050△050±033△E組8108±035△213±074△124±061△067±042△F值2451379727641023P值<005<005<005<005

注：與A組比較，▲P<0.01；與B組比較，△P<0.05

2.2 各組小鼠血清CK-MB水平 B組小鼠CVB3接種后第4天CK-MB水平即有改變，第7～14天達(dá)到高峰，第21天降低。B組與A組相比，第4、7、14天血清CK-MB水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。C、D、E組小鼠第4、7、14天的血清CK-MB水平與B組相應(yīng)時間段比較均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但仍未降到正常水平，見表2。

Table2 Comparison of serum CK - MB level of mice in five groups at different time

組別只數(shù)第4天第7天第14天第21天A組8121±107 131±102 114±103 102±110B組8374±155▲598±236▲484±171▲263±237C組8305±124△371±212△347±101△237±204D組8346±156△544±245△434±122△242±211E組8351±136△528±241△427±178△253±216F值451890627088P值<005<005<005>005

注：與A組比較，▲P<0.01；與B組比較，△P<0.05

2.3 各組小鼠心肌組織12-LO mRNA相對表達(dá)量 不同時間段各組小鼠心肌組織12-LO mRNA相對表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。B組小鼠各時間段心肌12-LO mRNA相對表達(dá)量均高于A 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)； C、D、E組小鼠心肌組織12-LO mRNA相對表達(dá)量除第4天外，其他各時間點(diǎn)的表達(dá)量均低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。注藥第7天各組小鼠心肌組織中均有12-LO mRNA的表達(dá)，其中A組小鼠心肌組織12-LO mRNA低表達(dá)， B組小鼠心肌組織12-LO mRNA高表達(dá)， C、D、E組小鼠心肌組織中12-LO mRNA的表達(dá)均低于B組(見圖1)。

2.4 12-LO mRNA表達(dá)量與心肌組織病理積分的關(guān)系 C、D、E組小鼠12-LO mRNA表達(dá)量與心肌組織病理積分均呈正相關(guān)(C組：r=0.892，P<0.01；D組：r=0.520，P<0.05；E組：r=0.364，P<0.05)。

Table3 Comparison of 12-LO mRNA in myocardial tissue in five groups at different time

組別只數(shù)第4天第7天第14天第21天A組80109±0013 0113±0021 0121±0023 0117±0019 B組80623±0321▲1311±0208▲1018±0302▲0512±0025▲C組80578±0332 0789±0211△0667±0236△0413±0089△D組80611±0267 0945±0247△0784±0345△0473±0113△E組80619±0257 1109±0301△0855±0349△0591±0101△F值571415234831205P值<005<005<005<005

注：與A組比較，▲P<0.01；與B組比較，△P<0.05

注：1為DL-2000 Marker，2為A組，3為B組，4為C組，5為D組，6為E組，7為陰性對照組

圖1 RT-PCR檢測心肌12-LO電泳結(jié)果

Figure1 The agarose gel electrophoresis results of 12-LO of mice myocardial tissue detected by RT-PCR

2.5 12-LO mRNA表達(dá)量與血清CK-MB水平的關(guān)系 C、D、E組小鼠心肌組織12-LO mRNA表達(dá)量與血清CK-MB水平均呈正相關(guān)(C組：r=0.906，P<0.05；D組：r=0.492，P<0.05；E組：r=0.327，P<0.05)。

3 討論

通過CVB3感染BALB/C小鼠來誘發(fā)VMC，是構(gòu)建CVB3 VMC模型的經(jīng)典方法。VMC基本病理改變是心肌間質(zhì)的炎性細(xì)胞浸潤和心肌細(xì)胞的變性、壞死以及晚期出現(xiàn)纖維化改變等，本實(shí)驗(yàn)中心肌組織病理學(xué)檢查結(jié)果顯示空白對照組各期小鼠心肌組織均無病理變化，心肌肌纖維分布正常；模型組小鼠各時間段的心肌組織符合VMC的病理變化。另外，小鼠血清心肌酶的改變可作為心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志之一。臨床上常檢測的心肌酶指標(biāo)包括乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶(α-HBDH)、肌酸激酶(CK)、CK-MB。其中CK-MB是CK的同工酶之一，CK-MB大量存在于心肌組織中，在骨骼肌等組織內(nèi)也有少量存在，是心肌受損的急性期診斷指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谟^察小鼠在病毒接種后所發(fā)生心肌損害的動態(tài)變化，所以在評價(jià)心肌壞死的范圍及過程時檢測了CK-MB；結(jié)果顯示，模型組小鼠血清CK-MB水平在第4天時即開始升高,在第7天時明顯升高，并達(dá)到高峰，以后略有下降，第21天下降明顯，提示在CVB3感染初期小鼠心肌即出現(xiàn)損傷，有不同程度的炎性病變，而在CVB3感染后期該指標(biāo)有所下降，說明心肌可能出現(xiàn)一定程度的修復(fù)。經(jīng)12-LO抑制劑黃芩素治療的各組小鼠與模型組比較，各時間點(diǎn)小鼠心肌組織病理積分均減少，血清CK-MB水平降低(第21天除外)，提示黃芩素可減輕VMC病情。

近年來對12-LO的研究較多，其為重要的信號分子[5]，生長因子、細(xì)胞因子以及高糖均能刺激血管平滑肌細(xì)胞、單核細(xì)胞的12-LO 表達(dá)上調(diào)，大鼠頸動脈氣囊損傷后損傷區(qū)12-LO表達(dá)明顯增加，而且12-LO還參與了氧化應(yīng)激和過氧化物的形成，抑制動脈硬化程度。目前把心肌炎和12-LO聯(lián)系在一起的文獻(xiàn)很少，本實(shí)驗(yàn)通過RT-PCR半定量分析發(fā)現(xiàn)，空白對照組小鼠心肌組織12-LO mRNA呈現(xiàn)低表達(dá)量，模型組小鼠心肌組織12-LO mRNA表達(dá)量較空白對照組明顯增高，病毒感染后第4天12-LO mRNA表達(dá)開始升高，之后逐漸增高，第7～14天達(dá)高峰，而后隨時間的延長而略有下降，但仍維持在一個較高水平，提示CVB3病毒感染后14 d內(nèi)小鼠心肌組織中12-LO的表達(dá)呈時間依賴性。說明12-LO參與VMC的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示心肌組織病理積分和血清CK-MB水平與12-LO mRNA 表達(dá)量之間呈正相關(guān)關(guān)系，在一定程度上反映了VMC小鼠病情嚴(yán)重程度，提示12-LO的高表達(dá)可導(dǎo)致心肌損傷，且與VMC的病理過程密切相關(guān)。據(jù)此推測12-LO可能成為VMC治療的一個潛在的、有價(jià)值的靶點(diǎn)。

12-LO抑制劑黃芩素因其具有特異的作用靶點(diǎn)和良好的實(shí)驗(yàn)研究效果，有學(xué)者對其治療疾病的機(jī)制進(jìn)行了研究[6]。黃芩素不僅具有多種藥理活性，也是12-LO的特異性抑制劑，在由12-LO介導(dǎo)的疾病中發(fā)揮著積極作用[7-8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量的黃芩素均能有效降低小鼠心肌組織12-LO表達(dá)量，提示特異性12-LO抑制劑黃芩素對小鼠VMC具有一定的治療效果，通過干預(yù)12-LO的作用，可能會減輕VMC的心肌病理損害程度。由此推測黃芩素治療VMC的可能機(jī)制是通過抑制12-LO，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善小鼠心肌組織的病理變化，保護(hù)心肌細(xì)胞，為開發(fā)治療VMC的新藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Dobrian AD，Lieb DC，Cole BK，et al.Functional and pathological roles of the 12- and 15-lipoxygenases[J].Prog Lipid Res ，2011，50(1)：115-131.

2 蔣麗萍，陸陽，陳紅專.脂加氧酶及其抑制劑研究進(jìn)展[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2005，21(8)：897-901.

3 鄧婕，鄧玉蓮，許春萱，等.心肌炎動物模型：CoxB3感染BALB/c小鼠心肌炎[J].中國人獸共患病雜志，2001,17(6)：86-88.

4 Rezkalla S,Kloner RA,Khatib G，et al.Effect of metoprolol in acute coxsaekievinm B3 murine myoearditi[J].J Am Coll Cardiol，1988，12(2)：412-414.

5 Minamino T.Role of 12/15 lipoxygenase-induced inflammation in heart failure[J].Nihon Yakurigaku Zasshi,2011，138(5):187-191.

6 王雪峰,劉芳,謝彬,等.不同提取方法的黃芩制劑體外抗柯薩奇病毒B3m和保護(hù)細(xì)胞作用的比較研究[J].中國藥學(xué)雜志，2006,41(23):1788-1791.

7 徐紅芳.中藥黃芩的臨床配伍應(yīng)用及現(xiàn)代研究[J].中國中醫(yī)藥雜志，2008，5(11)：41.

8 許文杰，丁啟龍.黃芩素的藥理學(xué)研究進(jìn)展[J].江蘇藥學(xué)與臨床研究，2006，14(2)：35-39.