鄭麗英，黃新玲，張 焱，李新梅，李 靜，蘆永華，謝建新

肥胖是一種慢性營(yíng)養(yǎng)性疾病，其本質(zhì)是機(jī)體控制能量代謝平衡的機(jī)制紊亂，使體內(nèi)脂肪堆積過(guò)多和/或分布異常，是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果?，F(xiàn)代生活方式的改變和過(guò)度營(yíng)養(yǎng)導(dǎo)致的肥胖已成為嚴(yán)重的世界性健康問(wèn)題，截至2008年，全球超重(BMI>28 kg/m2)人數(shù)約為15億，其中肥胖(BMI>30 kg/m2)人數(shù)約為5億[1]。腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)廣泛存在于真核細(xì)胞中，是高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，對(duì)機(jī)體能量代謝平衡起著中樞調(diào)節(jié)作用，AMPK一旦激活，可關(guān)閉脂肪酸、三酰甘油、膽固醇等合成代謝途徑，開(kāi)啟糖酵解、葡萄糖攝取和脂肪酸氧化等分解代謝途徑。此外，AMPK通過(guò)介導(dǎo)某些激素和細(xì)胞因子的釋放和表達(dá)而作用下丘腦攝食中樞，調(diào)節(jié)攝食行為，引起肥胖或體質(zhì)量減輕[2-4]。

肥胖導(dǎo)致的炎癥及炎癥誘導(dǎo)的胰島素抵抗是發(fā)生代謝綜合征的關(guān)鍵，肥胖啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制是目前國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。肥胖患者脂肪細(xì)胞的脂解增加，游離脂肪酸(FFA)通過(guò)脂肪細(xì)胞表面的TLR4介導(dǎo)，啟動(dòng)核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)免疫炎癥信號(hào)通路，NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)炎性因子的表達(dá)，引發(fā)免疫炎癥反應(yīng)[5]。本研究以脂肪細(xì)胞為模型，探討AMPK與 NF-κBp65的相互作用，在細(xì)胞水平研究能量代謝與免疫調(diào)節(jié)間的關(guān)系，為闡明肥胖啟動(dòng)炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 成纖維細(xì)胞3T3-L1購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，脂多糖(LPS)、5氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸(AICAR)、Compound C、尼古丁、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素、油紅O購(gòu)自Sigma公司。高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、小牛血清購(gòu)自Gibco公司。Phospho-AMPKα(Thr172)、Phospho-NF-κBp65購(gòu)自Cell Signaling公司，Rabbit Anti-β-actin購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Pierce公司，腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自上海西唐生物科技有限公司，F(xiàn)FA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物科技有限公司，甲醛、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、磷酸一氫鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 成纖維細(xì)胞3T3-L1是來(lái)源于小鼠前脂肪細(xì)胞的細(xì)胞株，是國(guó)際上公認(rèn)的研究脂肪細(xì)胞分化的模型。常規(guī)培養(yǎng)條件：將成纖維細(xì)胞3T3-L1置于含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基、37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化、傳代。分化培養(yǎng)基A：含10%胎牛血清、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L胰島素、1 μmol/L地塞米松高糖DMEM培養(yǎng)基；分化培養(yǎng)基B：含10%胎牛血清、10 mg/L胰島素高糖DMEM培養(yǎng)基。常規(guī)培養(yǎng)(接觸抑制)2 d后，為分化第0天；換分化培養(yǎng)基A培養(yǎng)48 h，分化培養(yǎng)基B培養(yǎng)48 h，再用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，2 d換液1次，誘導(dǎo)分化第8～12天的成纖維細(xì)胞3T3-L1中90%～95%分化為成熟脂肪細(xì)胞，可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 油紅O染色 油紅O儲(chǔ)存液：5 g油紅O染料溶于100 ml異丙醇，充分溶解后0.45 μm濾器過(guò)濾，再以0.22 μm濾器過(guò)濾。將油紅O儲(chǔ)存液與雙蒸水按2∶3混勻靜置10 min，即為油紅O工作液。將誘導(dǎo)分化成熟的脂肪細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3遍，3.7%甲醛固定30 min，PBS再?zèng)_洗3遍，油紅O工作液染色60 min，再次雙蒸水清洗至背景透明，在倒置顯微鏡下觀察拍照。油紅O染色是成熟脂肪細(xì)胞的特異性染色方法，可將成熟脂肪細(xì)胞中的脂滴染成紅色。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組 取誘導(dǎo)分化第10天的脂肪細(xì)胞，空白對(duì)照組繼續(xù)高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；AICAR組將AICAR溶于三蒸水，加入高糖DMEM培養(yǎng)基中使AICAR工作濃度為0.5 mmol/L，培養(yǎng)1 h；Compound C組將Compound C溶于二甲基亞砜(DMSO)，加入高糖DMEM培養(yǎng)基中使Compound C工作濃度為10 μmol/L，培養(yǎng)1 h；LPS組將LPS溶于雙蒸水，加入高糖DMEM培養(yǎng)基中使LPS工作濃度為1 μg/ml，培養(yǎng)1 h；尼古丁組以雙蒸水稀釋尼古丁原液，吸取適量尼古丁液加入高糖DMEM培養(yǎng)基中使尼古丁工作濃度為6×10-5mol/L，培養(yǎng)1 h。各組細(xì)胞培養(yǎng)完成后提取蛋白并收集細(xì)胞培養(yǎng)液-80 ℃保存待測(cè)。

1.5 AMPK與NF-κBp65磷酸化水平 采用蛋白印跡法(Western blotting)進(jìn)行檢測(cè)：取30 μg細(xì)胞總蛋白于10% SDS PAGE凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。含5% BSA的Tris-Buffered Saline Tween-20(TBST)封閉2 h后，將單克隆抗體Phospho-NF-κBp65(Ser536)(93H1)Rabbit、Phospho-AMPKa(Thr172)(40H9)Rabbit用含5% BSA的TBST稀釋(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜6次，5 min/次，將辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG用含5% BSA的TBST稀釋(1∶30 000)，室溫孵育2 h，TBST洗膜6次，5 min/次。采用超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯影、洗片、顯帶，分析測(cè)量圖像軟件Imagepro-plus(IPP)對(duì)條帶進(jìn)行光密度分析。

1.6 IL-6、TNF-α及FFA水平 采用ELISA法檢測(cè)IL-6與TNF-α水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作；采用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)下各孔吸光度，根據(jù)吸光度值計(jì)算IL-6與TNF-α水平。采用比色法檢測(cè)FFA水平，其原理為：銅離子與FFA結(jié)合形成脂肪酸銅鹽可溶于氯仿，銅鹽水平與FFA水平成正比，而銅離子的水平可用銅試劑測(cè)定，由此可計(jì)算出FFA水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，各實(shí)驗(yàn)組設(shè)置3個(gè)平行組或重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，繪制柱狀圖以描述各組數(shù)據(jù)，采用t檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成纖維細(xì)胞3T3-L1分化的形態(tài)學(xué)變化 誘導(dǎo)分化前成纖維細(xì)胞3T3-L1增殖迅速，多呈梭形，分布均勻，胞質(zhì)中無(wú)脂滴(見(jiàn)圖1A)；誘導(dǎo)分化第4天，細(xì)胞處于生長(zhǎng)停滯期，在誘導(dǎo)分化過(guò)程中，細(xì)胞變大變圓，胞質(zhì)中出現(xiàn)脂滴(見(jiàn)圖1B)；隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞進(jìn)一步變大變圓，脂滴增多(見(jiàn)圖1C)；誘導(dǎo)分化第8～12天，90%以上細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞，油紅O染色脂滴成紅色(見(jiàn)圖1D)。

2.2 空白對(duì)照組與Compound C組和AICAR組AMPK及NF-κBp65表達(dá)水平 Compound C組AMPK表達(dá)水平低于空白對(duì)照組(t=0.26)，而AICAR組AMPK表達(dá)水平高于空白對(duì)照組(t=0.37)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2A、2B)；Compound C組NF-κBp65表達(dá)水平高于空白對(duì)照組(t=0.15)，而AICAR組NF-κBp65表達(dá)水平低于空白對(duì)照組(t=0.40)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖2A、2C)。

2.3 空白對(duì)照組與尼古丁組和LPS組AMPK及NF-κBp65表達(dá)水平 尼古丁組AMPK表達(dá)水平高于空白對(duì)照組(t=0.25)，而LPS組AMPK表達(dá)水平低于空白對(duì)照組(t=0.30)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖3A、3B)；尼古丁組NF-κBp65表達(dá)水平低于空白對(duì)照組(t=0.17)，而LPS組NF-κBp65表達(dá)水平高于空白對(duì)照組(t=0.44)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖3A、3C)。

2.4 空白對(duì)照組與Compound C組和AICAR組TNF-α及IL- 6水平 Compound C組TNF-α水平高于空白對(duì)照組(t=62.00)，而AICAR組TNF-α水平低于空白對(duì)照組(t=17.00)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)圖4A)；Compound C組IL-6水平高于空白對(duì)照組(t=28.00)，而AICAR組IL-6水平低于空白對(duì)照組(t=29.33)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見(jiàn)圖4B)。

注：A為誘導(dǎo)分化前(×100)，B為誘導(dǎo)分化第4天(×400)，C為誘導(dǎo)分化第6天(×200)，D為誘導(dǎo)分化第8天(油紅O染色，×400)

圖1 成纖維細(xì)胞3T3-L1分化的形態(tài)學(xué)變化

Figure1 Morphological change of 3T3-L1

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；A為AMPK與NF-κBp65電泳圖，B為AMPK表達(dá)水平，C為NF-κBp65表達(dá)水平

圖2 空白對(duì)照組與AICAR組和Compound C組AMPK及NF-κBp65表達(dá)水平

Figure2 Expression of AMPK and NF-κBp65 in blank control group,Compound C group and AICAR group

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；A為AMPK與NF-κBp65電泳圖，B為AMPK表達(dá)水平，C為NF-κBp65表達(dá)水平

圖3 空白對(duì)照組與尼古丁組和LPS組AMPK及NF-κBp65表達(dá)水平

Figure3 Expression of AMPK and NF-κBp65 in blank control group,nicotine group and LPS group

2.5 空白對(duì)照組與Compound C組和AICAR組FFA水平 Compound C組FFA水平高于空白對(duì)照組(t=13.567)，而AICAR組FFA水平低于空白對(duì)照組(t=126.75)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見(jiàn)圖5)。

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.05；A為T(mén)NF-α水平，B為IL-6水平

圖4 空白對(duì)照組與Compound C組和AICAR組TNF-α及IL- 6水平

Figure4 Levels of TNF-α and IL- 6 in blank control group,Compound C group and AICAR group

注：與空白對(duì)照組比較，*P<0.01

圖5 空白對(duì)照組與Compound C組和AICAR組FFA水平

Figure5 Levels of FFA in blank control group,Compound C group and AICAR group

3 討論

AMPK是一種異源三聚體蛋白，AMPK活性異?？蓪?dǎo)致能量代謝平衡失調(diào)，誘導(dǎo)組織產(chǎn)生胰島素抵抗[2-4]。許多研究將AMPK信號(hào)受損與包括肥胖、糖尿病和心血管疾病在內(nèi)的代謝綜合征聯(lián)系起來(lái)，因?yàn)檫@些疾病都有慢性炎癥反應(yīng)的存在。NF-κB作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子在體內(nèi)廣泛存在。細(xì)胞處于靜息狀態(tài)時(shí)，NF-κB在胞質(zhì)內(nèi)與IκB形成復(fù)合物，以失活狀態(tài)存在；當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，IκB發(fā)生磷酸化而從NF-κB二聚體上解離，NF-κB激活進(jìn)入核內(nèi)，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)炎性因子如TNF-α、IL-6、IL-1β的轉(zhuǎn)錄[5-6]。

本研究結(jié)果顯示，AICAR作用于成熟脂肪細(xì)胞后，在激活A(yù)MPK磷酸化的同時(shí)抑制了NF-κBp65磷酸化，并抑制脂肪細(xì)胞釋放IL-6、TNF-α、FFA；Compound C作用于脂肪細(xì)胞，在激活A(yù)MPK磷酸化的同時(shí)抑制了NF-κBp65磷酸化，促進(jìn)脂肪細(xì)胞分泌IL-6、TNF-α、FFA。研究表明，AICAR激活A(yù)MPK可抑制急慢性結(jié)腸炎、自身免疫性腦脊髓炎和囊腫性纖維化炎癥反應(yīng)等[7-8]；Compound C可通過(guò)抑制下丘腦AMPK活性而減少食物攝入，使小鼠體質(zhì)量減輕，還可通過(guò)增加p21表達(dá)水平而抑制前脂肪細(xì)胞增殖分化[9]。炎癥刺激和脂肪酸豐富的飲食可降低小鼠脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中AMPK活性并增加TNF-α的表達(dá)。在脂肪組織中，TNF-α通過(guò)上調(diào)蛋白磷酸酶2C的表達(dá)而抑制AMPK的活性[10]。目前的研究表明，抗炎脂肪因子可有效地減少炎癥通路的激活，尤其是NF-κB途徑。AMPK可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，誘發(fā)胰島素抵抗，在脂肪細(xì)胞中，AMPK活性與炎癥反應(yīng)之間存在密切聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，LPS作用于脂肪細(xì)胞后，在激活NF-κBp65磷酸化的同時(shí)抑制了AMPK磷酸化。肥胖時(shí)脂肪細(xì)胞釋放促炎性因子，如IL-6、TNF-α、FFA等，而抗炎性因子分泌減少，如脂聯(lián)素和白介素10(IL-10)等。NF-κB是脂肪組織中重要的炎性遞質(zhì)，肥胖個(gè)體較非肥胖個(gè)體IκBα表達(dá)水平低，NF-κBp65 DNA結(jié)合水平高，進(jìn)而導(dǎo)致脂肪組織中促炎性因子基因和蛋白表達(dá)增加[11]。脂源性抗炎性因子脂聯(lián)素和IL-10是炎癥反應(yīng)的強(qiáng)有力的抑制劑，可抑制LPS引起的炎癥反應(yīng)[12]。脂聯(lián)素可降低胰島素抵抗和動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程并增加脂肪酸氧化，而脂聯(lián)素的這些功能被認(rèn)為是通過(guò)激活A(yù)MPK實(shí)現(xiàn)的。體外試驗(yàn)表明，AICAR可通過(guò)激活A(yù)MPK而抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[12]。本研究結(jié)果顯示，LPS可激活NF-κBp65，降低AMPK活性，但AMPK的活性降低是否是由于NF-κB激活而導(dǎo)致炎性因子增加所引起尚需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

本研究結(jié)果還顯示，尼古丁作用于脂肪細(xì)胞后，在抑制NF-κBp65磷酸化的同時(shí)增加了AMPK磷酸化。尼古丁是香煙煙霧的主要成分，也是重要的免疫調(diào)節(jié)劑，具有獨(dú)特的機(jī)體免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。研究表明，尼古丁可抑制促炎性因子TNF-α、 白介素8(IL-8)、IL-6等的產(chǎn)生，具有一定的抗炎功能，且證實(shí)其作用機(jī)制為通過(guò)與中樞型煙堿型乙酰膽堿受體結(jié)合而抑制IκBα磷酸化，進(jìn)而抑制NF-κB核轉(zhuǎn)位及轉(zhuǎn)錄活性[13]。研究發(fā)現(xiàn)AMPK抑制劑Compound C可抑制尼古丁對(duì)脂肪酸合成酶(FAS)的作用，而AMPK激活劑AICAR則可促進(jìn)尼古丁對(duì)FAS活性的抑制。尼古丁可增強(qiáng)大鼠胰島素敏感性，該作用部分與尼古丁減少脂肪組織，尤其是內(nèi)臟脂肪組織量及降低血清三酰甘油水平有關(guān)[14]。

有研究顯示，AMPK活性下降與老齡有關(guān)，推測(cè)AMPK是壽命延長(zhǎng)的一個(gè)重要因素。本研究證實(shí)了AMPK與NF-κBp65之間存在相互作用，兩者在能量代謝與免疫調(diào)節(jié)方面密切相關(guān)。肥胖時(shí)機(jī)體出現(xiàn)的慢性免疫炎癥反應(yīng)可能與AMPK活性降低引發(fā)NF-κB信號(hào)增強(qiáng)有關(guān)，為解釋肥胖導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 邁克爾，莊稼英.關(guān)注肥胖、血壓和膽固醇的全球趨勢(shì)報(bào)告[J].糖尿病天地：臨床(下旬)，2011，5(3)：100-101.

2 Bai A，Ma AG，Yong M，et al.AMPK agonist downregulates innate and adaptive immune responses in TNBS-induced murine acute and relapsing colitis[J].Biochem Pharmacol，2010，80(11)：1708-1717.

3 Steinberg GR，Kemp BE.AMPK in Health and Disease[J].Physiol Rev，2009，89(3)：1025-1078.

4 Yang Z，Kahn BB，Shi H，et al.Macrophage alpha1 AMP-activated protein kinase(alpha1AMPK)antagonizes fatty acid-induced inflammation through SIRT1[J].J Biol Chem，2010，285(25)：19051-19059.

5 蘇雪梅，付勇，張莉，等.子癇前期患者胎盤(pán)組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB和腫瘤壞死因子-α的表達(dá)及其臨床意義[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2011，14(5)：1562.

6 Huang NL，Chiang SH，Hsueh CH，et al.Metformin inhibits TNF-alpha-induced IkappaB kinase phosphorylation IkappaB-alpha degradation and IL-6 production in endothelial cells through PI3K-dependent AMPK phosphorylation[J].Int J Cardiol，2009，134(2)：169-175.

7 Katerelos M，Mudge SJ，Stapleton D，et al.5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleoside and AMP-activated protein kinase inhibit signalling through NF-κB[J].Immunol Cell Biol，2010，88(7)：754-760.

8 Salminen A，Hyttinen JM,Kaamiranta K.AMP-activated protein kinase inhibits NF-κB signaling and inflammation：impact on healthspan and lifespan[J].J Mol Med，2011，89(7)：667-676.

9 Nam M，Lee WH，Base EJ，et al.Compound C inhibits clonal expansion of preadipocytes by increasing p21 level irrespectively of AMPK inhibition[J].Archives of Biochemistry and Biophys，2008，479(1)：74-81.

10 Sell H，Dietze-Schroeder D，Eckardt K，et al.Cytokine secretion by human adipocytes is differentially regulated by adiponectin，AICAR，and troglitazone[J].Biochem Biophys Res Commun，2006，343(3)：700-706.

11 Green CJ，Pedersen M，Pedersen BK，et al.Elevated NF-κB activation is conserved in human myocytes cultured from obese type 2 diabetic patients and attenuated by AMP-activated protein kinase[J].Diabetes，2011，60(11)：2810-2819.

13 李治華，趙青贊，張華，等.尼古丁對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞激活和白細(xì)胞介素6表達(dá)的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2011，46(2)：188-192.

14 An Z，Wang H，Song P，et al.Nicotine-induced activation of AMP-activated protein kinase inhibits fatty acid synthase in 3T3L1 adipocytes：a role for oxidant stress[J].J Biol Chem，2007，282(37)：26793-26801.