王海峰，楊 宏，胡禮炳，雷永虹，秦 揚(yáng)，李 俊，畢城偉，霍 倩

EZH2(enhancer of zeste homolog 2)-zeste基因增強(qiáng)子人類同源物是PcG(polycomb group)基因家族的重要成員，其與果蠅zeste基因增強(qiáng)子是同源基因。該基因能夠使組蛋白3第27位賴氨酸(H3K27)發(fā)生三甲基化，沉默與細(xì)胞分化、抑制增殖相關(guān)的基因，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[1]。近年研究表明EZH2在膀胱癌組織中表達(dá)增加，并且與浸潤轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，但其具體的作用機(jī)制未明確[2]。本研究采用基因工程技術(shù)，構(gòu)建靶向沉默EZH2的小干擾RNA(siRNA2)表達(dá)載體，將其導(dǎo)入膀胱癌細(xì)胞建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系，觀察該載體對細(xì)胞EZH2的表達(dá)抑制作用，為探討EZH2在膀胱癌中的作用機(jī)制及其基因治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 膀胱癌細(xì)胞株T24由我實(shí)驗(yàn)室保存，pEGFP-C1表達(dá)載體購自Clontech公司，RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、PBS緩沖液、胎牛血清、LipofectamineTM2000脂質(zhì)體購自美國Invitrogen公司，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔購自Santa Cruz公司，DH5a感受態(tài)細(xì)胞、小量質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒等購自北京天根生化公司，T4 DNA連接酶購自加拿大Fermentas公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組質(zhì)粒設(shè)計(jì)和構(gòu)建 根據(jù)GenBank提供的EZH2序列，使用在線設(shè)計(jì)軟件，通過比對基因序列，合成EZH2特異性siRNA2s序列5′-GGGAAAGUGUAUGAUAAUTT-3′，陰性對照組轉(zhuǎn)染入：FAM序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′。siRNA2正反義鏈經(jīng)退火形成具有粘性末端的互補(bǔ)雙鏈。按照小量質(zhì)粒提取純化試劑盒說明書提取質(zhì)粒pEGFP-C1，經(jīng)酶切、回收線性處理后與退火雙鏈DNA經(jīng)T4 DNA連接酶4 ℃過夜定向連接，并轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，并進(jìn)行酶切鑒定和測序分析。鑒定正確的陽性克隆命名為實(shí)驗(yàn)組pEGFP-C1-siEZH2，對照組為pEGFP-C1-FAM。

1.2.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞及穩(wěn)定細(xì)胞株的篩選 轉(zhuǎn)染前1 d，將生長狀態(tài)良好的T24細(xì)胞按照1×105個(gè)/孔接種于6孔板，置于37 ℃的5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日待細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，將重組質(zhì)粒pEGFP-C1-siEZH2轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染說明書進(jìn)行操作，2周后在熒光顯微鏡下觀察陽性克隆發(fā)出熒光，采用有限稀釋法獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)分為pEGFP-C1-siEZH2實(shí)驗(yàn)組和pEGFP-C1-FAM對照組和空白對照組。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測EZH2 mRNA表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后的T24細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，檢測其濃度和完整性后，先反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，再對EZH2和內(nèi)參GAPDH進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。EZH2上游引物5′-GCGCGGGACGAAGAATAATCAT-3′；下游引物5′-TACACGCTTCCGCCAACAAACT-3′。內(nèi)參GAPDH上游引物5′- GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游引物5′-GAGGGTCTCTCTCTTCCT-3′；反應(yīng)條件：95 ℃ 15 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 60 s，30個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增完畢后進(jìn)行熔解曲線分析：95℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析特異性。實(shí)時(shí)定量分析采用2-ΔΔCt方法計(jì)算T24細(xì)胞中EZH2 mRNA水平的相對變化。每一個(gè)樣品均做3個(gè)重復(fù)反應(yīng)。

1.2.4 免疫印跡法檢測EZH2蛋白的表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染72 h后各組細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，然后進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳，300 mA 2 h后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)上，經(jīng)過封閉后依次加入一抗(1∶100的兔抗人EZH2單抗)和二抗(1∶5 000 HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體)；經(jīng)曝光，顯影，定影處理；采用Quantity one 軟件對各條帶進(jìn)行灰度值分析。

2 結(jié)果

2.1 EZH2 siRNA2表達(dá)載體的測序鑒定 將酶切正確的片段連接成pEGFP-C1-siEZH2表達(dá)載體，膠回收后送去測序。將測序報(bào)告與欲得到的目的序列相比對，顯示插入的siEZH2片段序列完全正確，表明靶向EZH2的pEGFP-C1-siEZH2載體構(gòu)建成功(見圖1)。

2.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及篩選 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞48 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到綠色熒光，表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，經(jīng)G418加壓篩選獲得單克隆穩(wěn)定傳代細(xì)胞株(見圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞的EZH2 mRNA表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，pEGFP-C1-siEZH2實(shí)驗(yàn)組EZH2的mRNA表達(dá)水平(1.089±0.024)較pEGFP-C1-FAM對照組(1.475±0.637)和空白對照組(2.138±0.621)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖3)。

2.4 轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞的EZH2蛋白表達(dá) 免疫印跡法檢測結(jié)果顯示，T24膀胱癌細(xì)胞中pEGFP-C1-siEZH2實(shí)驗(yàn)組EZH2蛋白表達(dá)水平(0.087±0.120)，基本被沉默，與空白對照組(0.794±0.134)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見圖4)。

圖1 重組質(zhì)粒的DNA測序顯示插入的siEZH2基因片段序列完全正確

Figure1 The recombinant plasmid DNA sequencing showed that the siEZH2 gene sequence inserted exactly right

圖2 轉(zhuǎn)染后形成的穩(wěn)定高表達(dá)的單克隆細(xì)胞

Figure2 The stability of the high expression of monoclonal cells after transfection

圖3 轉(zhuǎn)染入EZH2 siRNA2的T24細(xì)胞的EZH2 mRNA表達(dá)減弱

Figure3 The EZH2 mRNA expression weaken in the T24 cells which was transfected by EZH2 siRNA2

注：1：空白對照組，2：pEGFP-C1-siEZH2實(shí)驗(yàn)組

圖4 siRNA2 轉(zhuǎn)染后T24細(xì)胞中EZH2蛋白的表達(dá)

Figure4 The protein expression of EZH2 in stably transfected by siRNA2 in T24 cells

3 討論

在我國，膀胱癌目前仍是最常見的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病是一個(gè)多因素混合，多基因參與，多步驟形成的過程。因此，如何減少膀胱腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，延長患者的生命，提高其生活質(zhì)量是需要解決的關(guān)鍵問題。

EZH2是1996年發(fā)現(xiàn)的一種新的人類基因，是PcG基因家族的核心成員，其不僅參與細(xì)胞生長調(diào)節(jié)，而且與人類多種惡性腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[3]。目前，關(guān)于PcG蛋白EZH2作為癌基因與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲能力以及預(yù)后的相關(guān)性已逐漸成為腫瘤的基礎(chǔ)研究和臨床研究的熱點(diǎn)。大量研究報(bào)道EZH2在多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，如前列腺癌[3]、乳腺癌[4]、卵巢癌[5]、胃癌[6]等。

Zhang等[7]發(fā)現(xiàn)在膀胱癌組織中EZH2高度表達(dá)，并且表達(dá)程度與膀胱癌的分期與分級密切相關(guān)。張嘉玲等[8]利用RNA干擾技術(shù)檢測EZH2在人肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)得出結(jié)論，EZH2沉默能夠有效地抑制人肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，為深入研究EZH2在非小細(xì)胞肺癌中的作用提供了研究基礎(chǔ)。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道EZH2在人膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，并且與膠質(zhì)瘤的病理分級呈正相關(guān)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)的EZH2表達(dá)可以抑制其增殖，并誘導(dǎo)其凋亡[9]。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近年來興起的新技術(shù)，其在功能基因組學(xué)研究領(lǐng)域中受到越來越多的重視。因此，通過RNA干擾來抑制EZH2的表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，降低其侵襲能力。

為了了解EZH2在膀胱癌中的作用，探討以EZH2為靶點(diǎn)治療膀胱癌的可能性，本研究采用RNA干擾技術(shù)，以EZH2為靶基因，構(gòu)建EZH2特異性siRNA2真核表達(dá)載體，通過LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)包含有特異性siRNA2轉(zhuǎn)到膀胱腫瘤T24細(xì)胞內(nèi)，使得T24細(xì)胞EZH2表達(dá)的基因沉默。本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測定經(jīng)RNA干擾后人膀胱癌細(xì)胞株T24中EZH2 mRNA的表達(dá)變化，與pEGFP-C1-FAM對照組和空白對照組相比，重組質(zhì)粒pEGFP-C1-siEZH2轉(zhuǎn)入細(xì)胞后使T24中EZH2 mRNA表達(dá)明顯受到抑制，表達(dá)水平降低，但是內(nèi)參GAPDH mRNA表達(dá)水平無明顯差異。說明siRNA2的干擾作用具有高效性和高特異性；免疫印跡法檢測結(jié)果提示T24細(xì)胞中pEGFP-C1-siEZH2實(shí)驗(yàn)組與空白對照組比較，EZH2蛋白表達(dá)基本被沉默，說明特異性沉默EZH2的真核表達(dá)載體構(gòu)建成功，siRNA2特異性導(dǎo)致EZH2 mRNA降解，長期有效地沉默了EZH2在人膀胱癌細(xì)胞T24中的表達(dá)。

綜上所述，通過基因庫合成針對EZH2的特異性siRNA2，有效抑制膀胱癌T24細(xì)胞株EZH2的表達(dá)，為后續(xù)進(jìn)行EZH2在膀胱癌中的機(jī)制研究以及以EZH2為靶點(diǎn)的膀胱癌基因治療研究奠定了基礎(chǔ)。

1 Tsang DP，Cheng AS.Epigenetic regulation of signaling pathways in cancer：role of the histone methyltransferase EZH2[J].Journal of Gastroenterology and Hepatology，2011，26(1)：19-27.

2 Wang H，Albadine R，Magheli A，et al.Increased EZH2 protein expression is associated with invasive urothelial carcinoma of the bladder[J].Urologic Oncology，2012，30(4)：428-433.

3 Karanikolas BD，F(xiàn)igueiredo ML，Wu L.Polycomb group protein enhancer of zeste 2 is an oncogene that promotes the neoplastic transformation of a benign prostatic epithelial cell line[J].Molecular Cancer Research，2009，7(9)：1456-1465.

4 Ding L，Erdmann C，Chinnaiyan AM，et al.Identification of EZH2 as a molecular marker for a precancerous state in morphologically normal breast tissues[J].Cancer Research，2006，66(8)：4095-4099.

5 Rao ZY，Cai MY，Yang GF，et al.EZH2 supports ovarian carcinoma cell invasion and/or metastasis via regulation of TGF-beta1 and is a predictor of outcome in ovarian carcinoma patients[J].Carcinogenesis，2010，31(9)：1576-1583.

6 Choi JH，Song YS，Yoon JS，et al.Enhancer of zeste homolog 2 expression is associated with tumor cell proliferation and metastasis in gastric cancer[J].APMIS，2010，118(3)：196-202.

7 Zhang YB，Niu HT，Chang JW，et al.EZH2 silencing by RNA interference inhibits proliferation in bladder cancer cell lines[J].European Journal of Cancer Care，2011，20(1)：106-112.

8 張嘉玲，蘇秀蘭，閆美榮，等.shRNA沉默EZH2表達(dá)對人肺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響[J].中華臨床醫(yī)師雜志：電子版，2011，5(20)：5871-5874.

9 Orzan F，Pellegatta S，Poliani PL，et al.Enhancer of Zeste 2(EZH2)is up-regulated in malignant gliomas and in glioma stem-like cells[J].Neuropathology and Applied Neurobiology，2011，37(4)：381-394.