李曉冰，陳玉龍，展俊平，謝忠禮，朱艷琴，沈小君，李瑞琴

大量臨床及藥理實(shí)驗(yàn)證明，枸杞多糖具有降低血糖水平的功效[1-4]。糖尿病患者在持續(xù)高血糖水平狀態(tài)下易出現(xiàn)大血管及微血管并發(fā)癥，誘發(fā)各種感染及酮癥酸中毒，這些并發(fā)癥的出現(xiàn)與糖尿病患者免疫功能低下密切相關(guān)[5]。然而，目前關(guān)于枸杞多糖的報(bào)道多集中于改善糖尿病癥狀，對于具體機(jī)制研究較少。本研究從免疫學(xué)角度探討枸杞多糖治療糖尿病的機(jī)制，以期為枸杞多糖的臨床應(yīng)用及功能性食品的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 Wister大鼠70只，全部雄性，體質(zhì)量(200±20)g，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物許可證編號為SCXK(冀)2008-1-003。

1.2 主要藥物及試劑 枸杞多糖(批號：H22023655，寧夏啟元藥業(yè)有限公司)，四甲基偶氮唑鹽(Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT，美國Amresco公司)，鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma公司)；鼠淋巴細(xì)胞分離液(深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司)，抗大鼠FITC-CD3、PE-CD4、PE-CY5-CD8抗體(美國eBioscience公司)；葡萄糖試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 動物造模及分組 70只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，隨機(jī)選取12只為正常對照組，其余大鼠尾靜脈注射STZ制備1型糖尿病大鼠模型[6]，作為造模組。第7天尾部取血測血糖水平，選取血糖水平>11.1 mmol/L的大鼠48只，納入實(shí)驗(yàn)[7]。將48只大鼠隨機(jī)分為4組，模型組12只、多糖高劑量組12只、多糖中劑量組12只、多糖低劑量組12只。多糖低、中、高劑量組按照預(yù)實(shí)驗(yàn)分別按100、200、400 mg/kg枸杞多糖灌胃給藥，正常對照組和模型組使用同體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。1次/d，持續(xù)4周。各組末次給藥24 h后腹主動脈取血，無菌取脾臟、胸腺。

1.4 檢測指標(biāo)與方法

1.4.1 血糖水平測定 按試劑盒說明書測定不同時間段(造模第2、4周)血糖水平。

1.4.2 脾臟、胸腺指數(shù)測定 乙醚麻醉取血后，處死大鼠。剝離脾臟、胸腺，稱重。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量，胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.4.3 脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) 取各組大鼠6只，無菌取出脾臟放入盛有少量磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)的培養(yǎng)皿中，用5 ml注射器針芯研磨脾臟，移入離心管中，用吸管吹打數(shù)次，300目尼龍布過濾，1 500 r/min離心5 min，收集細(xì)胞，2 ml紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，用PBS緩沖液洗3遍，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度2×106/ml，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔取100 μl細(xì)胞懸液，加100 μl含10%新生牛血清及青、鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，每份標(biāo)本重復(fù)6個孔，其中3個為試驗(yàn)孔，每孔加20 μl脂多糖，另外3個為對照孔。置培養(yǎng)箱中在飽和濕度5%二氧化碳(CO2)、37 ℃條件下，培養(yǎng)48 h，加入MTT 10 μl，避光培養(yǎng)4 h；離心(400 g，10 min)，吸棄上清液，再加入二甲基亞砜(DMSO)溶液100 μl，于酶標(biāo)儀上測定波長為570 nm時的吸光度值(A570)。計(jì)算脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)(SI)=A試驗(yàn)孔/A對照孔[8]。

2 結(jié)果

2.1 造模初始造模組血糖水平為(18.8±3.8)mmol/L，較正常對照組血糖水平(5.6±1.0)mmol/L升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.15，P<0.01)，說明造模成功。且模型組血糖水平為(18.8±3.8)mmol/L、多糖低劑量組為(18.5±3.2)mmol/L、多糖中劑量組為(18.5±2.5)mmol/L、多糖高劑量組為(18.4±2.7)mmol/L，4組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.291，P>0.05)，具有可比性。

2.2 不同時間點(diǎn)血糖水平的比較 4組大鼠在第2周和第4周血糖水平的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。第2周和第4周多糖組血糖水平均較模型組降低(P<0.01)，但多糖組兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)血糖水平比較

注：與模型組比較，*P<0.01

2.3 4周后脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和SI的比較 4組大鼠4周后胸腺指數(shù)和SI的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多糖組的胸腺指數(shù)和SI均較模型組升高(P<0.01)，且多糖中劑量組和多糖高劑量組的SI均較多糖低劑量組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

Table2 Comparison of spleen index，thymus index，spleen lymphocyte stimulation indices in each group

組別只數(shù)脾臟指數(shù)(mg/g)胸腺指數(shù)(mg/g)SI模型組120.38±0.080.47±0.07 0.74±0.18 多糖低劑量組120.42±0.080.95±0.18*0.93±0.32* 多糖中劑量組120.44±0.061.30±0.24*1.22±0.19*☆ 多糖高劑量組120.45±0.101.14±0.15*1.24±0.24*☆★F值2.39672.72716.779P值0.0810.0000.000

注：SI=脾淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)；與模型組比較，*P<0.01；與多糖低劑量組比較，☆P<0.01；與多糖中劑量組比較，★P<0.01

2.4 4周后外周血T淋巴細(xì)胞值的比較 4組大鼠4周后外周血T淋巴細(xì)胞CD3、CD4、CD8及CD4/CD8值的比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。多糖組的CD3、CD4及CD4/CD8值均較模型組升高(P<0.01)；多糖組的CD8值較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

Table3 Comparison of peripheral blood T lymphocyte CD3，CD4，CD8and CD4/CD8in each group

組別只數(shù)CD3(%)CD4(%)CD8(%)CD4/CD8模型組1248.5±10.8 33.2±11.7 26.4±6.2 1.7±0.3 多糖低劑量組1261.0±15.9*44.4±16.7*21.2±3.4*2.1±0.3* 多糖中劑量組1263.6±20.1*44.4±13.5*20.5±5.5*2.2±0.4* 多糖高劑量組1267.2±19.5*47.3±15.8*19.9±6.0*2.4±0.4*☆★F值3.6062.8524.5529.838P值0.0210.0480.0070.000

注：與模型組比較，*P<0.01；與多糖低劑量組比較，☆P<0.05；與多糖中劑量組比較，★P<0.05

3 討論

胸腺是T淋巴細(xì)胞分化和發(fā)育的場所，是機(jī)體重要的中樞免疫器官。脾臟是最大的淋巴器官，也是重要的外周免疫器官之一，含有大量的T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞及淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞等。脾臟也是對血源性抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答的場所，因此，胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)間接反映了機(jī)體的免疫狀況[9]。本研究顯示，經(jīng)枸杞多糖干預(yù)后，多糖組的胸腺指數(shù)和SI均顯著升高，且中、高劑量的枸杞多糖較低劑量的枸杞多糖更有利于改善SI。

綜上所述，枸杞多糖可在一定程度上提高糖尿病大鼠的胸腺指數(shù)和SI，改善糖尿病大鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD3、CD4及CD8亞群比例。而枸杞多糖降血糖功效與提高免疫力之間是否存在某種關(guān)聯(lián)，還有待于進(jìn)一步研究。

1 趙蕊，李青旺，張冰梅.枸杞多糖-4a改善糖尿病大鼠胰島素抵抗作用的研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2009，36(9)：37-42.

2 劉宏婧，李宏輝，張焱，等.枸杞多糖對糖尿病雄性大鼠生殖損傷的保護(hù)作用[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，22(9)：2167-2168.

3 王繼紅，劉學(xué)政，那東波.枸杞多糖對糖尿病視網(wǎng)膜病變保護(hù)作用的研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12(6)：47-49.

4 侯陽，劉學(xué)政，王繼紅.枸杞多糖對糖尿病大鼠血糖水平、血脂及血-視網(wǎng)膜屏障通透性的影響[J].中華實(shí)驗(yàn)眼科雜志，2011，29(11)：964-967.

5 王妲.糖尿病與感染[J].中華內(nèi)科雜志，1997，36(10)：716-717.

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7 趙云芳，耿宏偉，李瑞琴，等.降壓調(diào)脂膠囊對糖尿病早期腎損害大鼠PKC和TGF-β1表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2011，17(3)：284-286.

8 張旭，張國蓉，車偉，等.膠原蛋白多肽-鉻螯合物對糖尿病小鼠免疫力的影響[J].中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)報(bào)，2008，16(1)：10-13.

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11 趙宏艷.靈芝多糖對H22荷瘤小鼠腸道黏膜免疫功能的影響[D].中國中醫(yī)科學(xué)院，2008.