張?jiān)倥d

喉癌是我國(guó)北方地區(qū)最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤之一，近幾年其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，但目前其發(fā)病機(jī)制還不十分清楚。ARHI基因是母源性印跡腫瘤抑制基因[1]，該基因定位于1p31，分子量為26 000，結(jié)構(gòu)上與Ras家族具有高度同源性，屬于小分子G蛋白的一種。研究表明，盡管ARHI基因?qū)儆赗as超家族成員之一，但其與大部分Ras家族成員都是癌基因不同，ARHI基因具有抑癌作用[2-3]。目前，關(guān)于ARHI基因與喉鱗癌的關(guān)系研究鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究旨在探討ARHI蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇1996年11月—2012年10月在我院接受手術(shù)治療并經(jīng)兩位以上病理專(zhuān)家確診的喉鱗癌患者60例，其中男38例，女22例；年齡28～76歲，平均61.2歲；排除術(shù)前接受放療及化療的患者。

1.2 方法 手術(shù)切除癌組織后10 min內(nèi)取材，取材時(shí)避免取到明顯的壞死區(qū)域，同時(shí)選取其中30例患者的癌旁組織作為對(duì)照，癌旁組織為距癌組織至少0.5 cm處遠(yuǎn)端正常喉組織。采用免疫組化法(SP法)檢測(cè)ARHI蛋白的表達(dá)，試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

將切取的組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋、切片后于60 ℃烤箱干烤4 h，常規(guī)脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫溶液浸泡10 min滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后加入10 mmol/L濃度pH 6.0枸櫞酸鈉緩沖液于100 ℃煮沸10 min，進(jìn)行抗原修復(fù)；室溫自然冷卻30 min后加入正常馬血清，室溫下封閉20 min，加入一抗小鼠抗人ARHI單克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology)，按1∶100稀釋?zhuān)? ℃過(guò)夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后加入生物素化二抗，室溫30 min，PBS洗滌3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，室溫下封閉30 min，PBS洗滌3次，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，中性樹(shù)膠封固后于光鏡下進(jìn)行觀察。

1.3 結(jié)果判定 結(jié)果判定由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富且不知曉本研究?jī)?nèi)容的病理科醫(yī)生完成，用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判定方法參照文獻(xiàn)[3-4]：每張切片隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞；根據(jù)陽(yáng)性區(qū)域染色強(qiáng)度評(píng)分(0分：無(wú)著色；1分：淡黃色；2分：黃色；3分：棕黃色)及陽(yáng)性細(xì)胞所占比例評(píng)分(0分：1%；1分：1%～10%；2分：11%～50%；3分：51%～75%；4分：76%～100%)進(jìn)行半定量評(píng)分，計(jì)算兩項(xiàng)評(píng)分的乘積，分值范圍為0～12分，以乘積>3分為ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARHI蛋白的表達(dá) 光鏡觀察結(jié)果顯示，癌旁組織中胞質(zhì)及部分胞核可見(jiàn)大量棕黃色顆粒(見(jiàn)圖1)，喉鱗癌組織中胞質(zhì)及胞核中可見(jiàn)少量棕黃色顆粒(見(jiàn)圖2)。癌旁組織ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為83.33%(25/30)，喉鱗癌組織ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為48.33%(29/60)，喉鱗癌組織ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于癌旁組織 (χ2=10.21，P<0.01)。

圖1 癌旁組織中ARHI蛋白的表達(dá)(SP法,×400)

2.2 ARHI蛋白表達(dá)與患者臨床特征間的關(guān)系 不同性別、年齡、原發(fā)部位喉鱗癌患者ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；臨床分期Ⅰ～Ⅱ期喉鱗癌患者ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于Ⅲ～Ⅳ期者(P<0.05)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的喉鱗癌患者ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率低于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，病理分級(jí)高中分化喉鱗癌患者ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高于低分化者(P<0.05，見(jiàn)表1)。

圖2 喉鱗癌組織中ARHI蛋白的表達(dá)(SP法,×400)

Figure2 Expression of ARHI protein in laryngeal squamous cell carcinoma tissues

表1 ARHI蛋白表達(dá)與患者臨床特征間的關(guān)系

Table1 Relationship between expression of ARHI protein and patients′clinical features

臨床特征例數(shù)ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率〔n(%)〕χ2值P值性別0.29>0.05 男3818(47.37) 女2212(54.55)年齡(歲)1.07>0.05 ≥602816(57.14) <603214(43.75)原發(fā)部位0.23>0.05 聲門(mén)上區(qū)2214(63.64) 聲門(mén)區(qū)3520(57.14)臨床分期5.05<0.05 Ⅰ～Ⅱ2115(71.43) Ⅲ～Ⅳ3916(41.03)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5.45<0.05 無(wú)4842(87.50) 有1216(41.03)病理分級(jí)5.39<0.05 高中分化3731(81.08) 低分化2313(56.52)

注：有3例患者原發(fā)部位為聲門(mén)下區(qū)病變，未納入統(tǒng)計(jì)分析

3 討論

喉癌中90%以上為鱗狀細(xì)胞癌，而在喉鱗癌確診時(shí)約有40%的患者已為晚期，患者5年生存率在50%以下[5]，因此，喉鱗癌的早期診斷非常重要。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展和癌變研究的逐漸深入，一些與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的癌基因和抑癌基因相繼被發(fā)現(xiàn)[6]。ARHI基因編碼的蛋白在人類(lèi)多種組織中表達(dá)，其中以正常乳腺、卵巢組織中的表達(dá)最高，而在大多數(shù)乳腺癌、卵巢癌組織中，其表達(dá)明顯缺失或降低[4，7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，ARHI蛋白在胃癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)或缺失,而在胃正常組織中普遍表達(dá)，且ARHI蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度及TNM分期有關(guān)[9]。因此，ARHI蛋白可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

本研究結(jié)果顯示，喉鱗癌組織中ARHI蛋白陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于癌旁組織，與其他學(xué)者在肝癌、前列腺癌等癌組織的檢測(cè)結(jié)果基本一致[10-13]，提示ARHI蛋白表達(dá)在喉鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。通過(guò)分析ARHI蛋白與患者臨床特征間的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，ARHI的低表達(dá)與患者臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理分級(jí)有關(guān)，提示ARHI蛋白可能與腫瘤組織上皮分化、病變進(jìn)展及侵襲性有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證明，ARHI蛋白可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，死亡相關(guān)蛋白激酶1(DAPK-1)參與了ARHI蛋白引起的凋亡[3]。此外，也有研究發(fā)現(xiàn)ARHI基因可通過(guò)誘導(dǎo)G1期細(xì)胞而抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[1,3]。由于ARHI基因突變或失活，導(dǎo)致ARHI蛋白低水平表達(dá)或表達(dá)缺失，從而失去了其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的負(fù)性調(diào)控作用，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

綜上所述，ARHI蛋白的低表達(dá)可能是喉鱗癌發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的一個(gè)重要事件，檢測(cè)ARHI蛋白的表達(dá)在喉鱗癌的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估中可能具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，其可能成為喉鱗癌分子標(biāo)志物或治療的潛在靶點(diǎn)；而有關(guān)ARHI蛋白在喉鱗癌組織中表達(dá)的具體機(jī)制還有待應(yīng)用分子生物學(xué)方法進(jìn)一步研究。

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