李 晶，姜 北，萬(wàn) 鵬，李 娜，王于理，鞏 平

肺癌是嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，是目前病死率最高的惡性腫瘤，而患者死亡的主要原因是腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1-3]。血行播散是肺癌轉(zhuǎn)移的重要途徑，腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)血液循環(huán)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTC) 是指自發(fā)或因診療操作進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，與腫瘤血行轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤轉(zhuǎn)移的環(huán)節(jié)中扮演重要角色[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)患者化療前后外周血CTC表達(dá)情況，分析其與臨床特征、療效的關(guān)系，探討CTC預(yù)測(cè)晚期NSCLC化療療效的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2011年6月—2012年2月石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的晚期原發(fā)NSCLC患者30例為肺癌組，其中男17例，女13例；年齡 43～79歲,中位年齡 67歲。均經(jīng)病理或活檢證實(shí)為NSCLC，按2010年美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)NSCLC標(biāo)準(zhǔn)分為：ⅢA、ⅢB及Ⅳ期。入組前均未接受任何抗腫瘤治療，預(yù)計(jì)生存期>3個(gè)月，依從性好。收集同期入院治療的肺良性疾病及健康志愿者各10例為對(duì)照組，其中男11例，女9例；年齡34～68歲，中位年齡52歲。兩組患者性別構(gòu)成和年齡具有均衡性，均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑 人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊镏破酚邢薰?；小鼠抗人?xì)胞角蛋白(cytokeratin,AE1/AE3)單克隆抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；異硫氰酸熒光素(fluoresce in isothiocyanate,FITC)標(biāo)記羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；肺腺癌A549細(xì)胞株為湖南湘雅醫(yī)學(xué)院李彩霞老師惠贈(zèng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 標(biāo)本采集 嚴(yán)格消毒后，應(yīng)用真空采血針采取肘正中靜脈血，棄去穿刺后的前2 ml，采集此后的7.5 ml靜脈血。所有血樣加入肝素抗凝混勻，并在采集后24 h內(nèi)富集腫瘤細(xì)胞。

1.3.2 密度梯度離心法富集腫瘤細(xì)胞 取7.5 ml抗凝全血與等量磷酸鹽緩沖液(PBS)混勻，小心加至細(xì)胞分離液層面上(2∶1)；室溫下2 000 r/min(離心半徑16 cm)，離心20 min；吸取環(huán)狀乳白色單核細(xì)胞層，加入5 ml PBS重復(fù)洗滌2次，室溫下2 000 r/min(離心半徑16 cm)，離心15 min。

1.3.3 免疫熒光法染色 將富集所得單個(gè)核細(xì)胞懸液均勻涂于載玻片上,室溫下靜置30 min后用4%多聚甲醛固定抗原10 min,PBS清洗5 min×3次(待玻片干燥后可置-80 ℃冰箱統(tǒng)一染色)；0.1%Triton X-100通透胞膜15 min(室溫),PBS清洗5 min×3次；5%牛血清清蛋白(BSA)封閉30 min (37 ℃),PBS清洗5 min×3次；滴加小鼠抗人Pan-細(xì)胞角蛋白(CK) (1∶100),4 ℃過(guò)夜，PBS清洗5 min×3次，滴加 FITC標(biāo)記羊抗小鼠 IgG (1∶100),室溫下孵育2 h，PBS清洗5 min×3次；在細(xì)胞區(qū)加入7 μl DAPI染細(xì)胞核，最后加蓋玻片封固。免疫熒光顯微鏡下觀察、照相。以對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的肺腺癌A549細(xì)胞株為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS代替一抗為陰性對(duì)照。整個(gè)過(guò)程注意避光操作。

1.3.4 CTC陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn) (1)細(xì)胞呈圓形、橢圓形或長(zhǎng)型，核質(zhì)比較血細(xì)胞明顯增大[5-7]；(2)同時(shí)染綠色(CK陽(yáng)性)和藍(lán)色 (DAPI陽(yáng)性)熒光，熒光下細(xì)胞形態(tài)完整；(3)光鏡下可見(jiàn)完整的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核。陰性對(duì)照：對(duì)照組外周血單個(gè)核細(xì)胞。由兩人在熒光顯微鏡下分別觀察細(xì)胞顯色情況，按照以上標(biāo)準(zhǔn)采集陽(yáng)性細(xì)胞圖像，有分歧的細(xì)胞圖像由兩人共同判定結(jié)果。目前CTC陽(yáng)性判定尚無(wú)國(guó)際化標(biāo)準(zhǔn)，本文以見(jiàn)到CTC即為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4 肺癌組療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 肺癌組患者按規(guī)范行化療，于化療前及化療2個(gè)周期結(jié)束后檢測(cè)外周血CTC，每2個(gè)周期行全面檢查及療效評(píng)估。按照實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)(RECIST)評(píng)價(jià)[8]，分為完全緩解(CR)、部分緩解(PR)、穩(wěn)定(SD)及進(jìn)展(PD)；CTC數(shù)目評(píng)價(jià)療效為7.5 ml 外周血中腫瘤細(xì)胞數(shù)目下降>1個(gè)為緩解(RR)、不變?yōu)镾D、上升>1個(gè)為PD[9]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)數(shù)資料比較采用Fisher確切概率法、配對(duì)設(shè)計(jì)的χ2檢驗(yàn)及列聯(lián)表分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組外周血中未檢出腫瘤細(xì)胞，肺癌組患者外周血中18例(60%)檢出腫瘤細(xì)胞；兩組CTC陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。肺癌細(xì)胞株A549(陽(yáng)性對(duì)照)經(jīng)熒光染色，細(xì)胞內(nèi)有綠色(胞質(zhì))及藍(lán)色(胞核)熒光分布，肺癌細(xì)胞內(nèi)有CK表達(dá)。

2.2 CTC與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系 CTC陽(yáng)性與NSCLC患者年齡、性別、是否吸煙、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度均無(wú)關(guān)(P>0.05)；CTC陽(yáng)性與NSCLC患者病理分期有關(guān)(P<0.05，見(jiàn)表1)。

表1 CTC陽(yáng)性與NSCLC患者臨床特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3 化療前后CTC陽(yáng)性率比較 化療前檢測(cè)CTC陽(yáng)性18例，陽(yáng)性率為60%；化療后檢測(cè)CTC陽(yáng)性11例，陽(yáng)性率為37%，化療前后CTC陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.016)。

2.4 CTC數(shù)目評(píng)價(jià)與RECIST評(píng)價(jià)對(duì)療效的判定比較 化療2個(gè)周期完成后進(jìn)行療效評(píng)價(jià)，CTC數(shù)目評(píng)價(jià)與RECIST評(píng)價(jià)療效比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.000,P>0.05)，且兩種評(píng)價(jià)方法具有一定的吻合度(κ=0.557，見(jiàn)表2)。相關(guān)分析顯示，CTC數(shù)目與臨床療效呈負(fù)相關(guān)(r=-0.434,P=0.017)。

表2 CTC數(shù)目評(píng)價(jià)與RECIST評(píng)價(jià)對(duì)療效的判定比較(例)

Table2 Comparison of the evaluation of effect by CTC number and RECIST

CTC數(shù)目評(píng)價(jià)RECIST評(píng)價(jià) PR SD PD 合計(jì) RR5 3 0 8 SD016016PD2 2 2 6 合計(jì)721230

注：PR=部分緩解，SD=穩(wěn)定，PD=進(jìn)展，RR=緩解

3 討論

密度梯度離心法具有價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞回收率高等優(yōu)點(diǎn),是目前常用的CTC富集分離方法之一；免疫熒光法是最常用的CTC檢測(cè)方法之一,二者結(jié)合可顯著提高腫瘤細(xì)胞檢測(cè)的敏感度。CK可作為評(píng)估腫瘤血行微轉(zhuǎn)移的較敏感的指標(biāo)，但以CK單一指標(biāo)作為判斷存在腫瘤細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。本研究結(jié)合細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析,熒光顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞可進(jìn)一步在光鏡下獲得病理學(xué)的支持，排除非特異染色細(xì)胞的干擾,使檢測(cè)的特異度進(jìn)一步增強(qiáng)。本研究采用密度梯度離心法聯(lián)合免疫熒光法檢測(cè)外周血中CK陽(yáng)性的CTC，結(jié)果顯示30例NSCLC患者外周血中18例檢出腫瘤細(xì)胞，陽(yáng)性率為60%，與文獻(xiàn)報(bào)道[10-11]基本一致；20例對(duì)照者外周血中均未檢出腫瘤細(xì)胞，說(shuō)明本研究的檢測(cè)方法具有較高的特異度。

腫瘤細(xì)胞進(jìn)入外周血中形成 CTC 是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的前提[12]，雖然外周血中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞并不意味著一定存在轉(zhuǎn)移灶，但實(shí)驗(yàn)表明 CTC的存在與腫瘤患者的病理分期以及預(yù)后密切相關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示CTC陽(yáng)性與NSCLC患者年齡、性別、是否吸煙、組織學(xué)類(lèi)型、分化程度均無(wú)關(guān)，但與病理分期有關(guān)；Ⅳ期NSCLC患者CTC陽(yáng)性率明顯高于ⅢA及ⅢB期，提示CTC陽(yáng)性與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),進(jìn)一步證實(shí)CTC在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病灶形成中起重要作用。Sher等[14]在其研究中也發(fā)現(xiàn)晚期肺癌患者CTC陽(yáng)性率明顯高于早期患者，且CTC可作為T(mén)NM分期系統(tǒng)的有利補(bǔ)充。本研究納入的對(duì)象均為晚期NSCLC患者，研究樣本有限，需要繼續(xù)擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證CTC與肺癌患者臨床特征的關(guān)系。

本研究中比較了30例NSCLC患者化療前后CTC表達(dá)情況，治療后CTC陽(yáng)性率較治療前降低，提示CTC與治療相關(guān)。但本研究發(fā)現(xiàn)，2例持續(xù)PR患者仍可檢測(cè)出CTC。雖然文獻(xiàn)報(bào)道腫塊的大小和重量與CTC多少有關(guān)[15]，但這種相關(guān)性會(huì)受到多種因素的影響，如腫瘤組織本身對(duì)周?chē)艿那治g力以及局部組織壞死分解的速度；所以，治療后肺內(nèi)病灶明顯縮小的患者，由于腫瘤組織存在對(duì)微血管侵蝕和破壞的能力，此時(shí)脫落入循環(huán)的腫瘤細(xì)胞可形成微轉(zhuǎn)移或是二次轉(zhuǎn)移，因此化療后為CR、PR的患者仍有可能檢測(cè)出CTC。目前對(duì)于腫瘤細(xì)胞在循環(huán)中釋放是隨機(jī)還是具有周期性和規(guī)律性尚無(wú)明確定論，單獨(dú)一次檢查陰性不能排除瘤細(xì)胞脫落入血的可能性，因此多時(shí)間點(diǎn)、多次采集標(biāo)本來(lái)檢查CTC更為合理。

本研究30例NSCLC患者化療2個(gè)周期后行CTC數(shù)目評(píng)價(jià)與RECIST評(píng)價(jià)對(duì)療效進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果提示兩種評(píng)價(jià)方法無(wú)差異，且兩種評(píng)價(jià)方法具有一定的吻合度；相關(guān)分析表明，CTC數(shù)目與臨床療效呈負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果顯示，CTC與療效有相關(guān)性，通過(guò)CTC數(shù)目可以預(yù)測(cè)晚期NSCLC患者的化療療效，相比RECIST評(píng)價(jià)更能反映患者病情的微觀變化和腫瘤轉(zhuǎn)移的特征，具有前瞻性、簡(jiǎn)便性和可重復(fù)性等優(yōu)點(diǎn)，有利于NSCLC患者的個(gè)體化治療。這與Cohen等[16]和Punnoose等[17]的研究結(jié)果相一致。Punnoose等在一項(xiàng)NSCLC的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中觀察到，患者化療后CTC水平較基線水平下降，并與18氟脫氧葡萄糖正電子發(fā)射斷層掃描(18FDG-PET)影像學(xué)檢查的結(jié)果吻合，這部分患者獲得了較長(zhǎng)的無(wú)腫瘤進(jìn)展生存期，研究提示，CTC水平的下降可作為有效治療應(yīng)答的早期指標(biāo)。對(duì)于治療后CTC高水平的肺癌患者是否能從其他治療方案中獲益，需要更大規(guī)模的試驗(yàn)和臨床研究來(lái)驗(yàn)證。

目前眾多的研究顯示CTC可以預(yù)測(cè)腫瘤的侵襲性，其存在提示患者預(yù)后較差。Wu等[10]認(rèn)為CTC≥2個(gè)/7.5 ml組的非小細(xì)胞肺癌患者較CTC<2個(gè)/7.5 ml組的生存期更短。本研究時(shí)間較短，尚不能對(duì)入組患者預(yù)后進(jìn)一步分析探討，需長(zhǎng)期隨訪后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?？傊?，CTC在肺癌患者中具有巨大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值；隨著這一研究領(lǐng)域的不斷發(fā)展，將促進(jìn)我們進(jìn)一步深入了解CTC與肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，為臨床應(yīng)用及肺癌個(gè)性化治療提供新的方向。

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