張峻嶺,柳君如，徐士福,程 琳，馬秀亮

白癜風(fēng)為一種自身免疫相關(guān)性皮膚病已成共識，研究發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者皮損內(nèi)殺傷性T淋巴細(xì)胞浸潤可以直接破壞黑素細(xì)胞，近年發(fā)現(xiàn)，免疫系統(tǒng)失調(diào)與基因的差異表達(dá)密切相關(guān)。國外學(xué)者Yu等[1]應(yīng)用基因芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)皮損區(qū)CLEC2B mRNA表達(dá)高于非皮損區(qū)。筆者應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法，發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者皮損區(qū)CLEC2B基因較正常人表達(dá)增加,并發(fā)現(xiàn)CLEC2B基因過表達(dá)的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液對黑素細(xì)胞的增殖和黑素合成有一定的抑制作用[2],同時(shí)發(fā)現(xiàn)CLEC2B基因過表達(dá)可上調(diào)與白癜風(fēng)密切相關(guān)的細(xì)胞因子可溶性白介素2受體(sIL-2R)mRNA的表達(dá)。為進(jìn)一步闡明CLEC2B基因在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用，在此基礎(chǔ)上本研究利用RNA干擾技術(shù)，使 CLEC2B基因沉默，觀察CLEC2B基因沉默后淋巴細(xì)胞sIL-2R mRNA的變化，旨在探索該基因功能相關(guān)細(xì)胞因子及其參與的信號傳導(dǎo)途徑，從而推測該基因參與白癜風(fēng)發(fā)病的免疫學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料 DMRIE-C脂質(zhì)體及OPTI MEM購于美國Invitrogen公司，CLEC2B引物序列由不列顛哥倫比亞大學(xué)Youwen zhou教授惠贈，CLEC2B siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，RPMI 1640液態(tài)培養(yǎng)基購于美國Gibco公司,DMEM高糖液態(tài)培養(yǎng)基、TBD胎牛血清購于天津?yàn)笊锟萍加邢薰?，TRIzol、TRANScript cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal PreMix(SYBR Green I)均購于天根生化科技(北京)有限公司，MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢驗(yàn)試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司，DMSO購于美國Sigma公司，人Jurkat淋巴瘤細(xì)胞株來自中國科學(xué)院血液病研究所。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)條件均為37 ℃，5%二氧化碳(CO2)進(jìn)行培養(yǎng)，Jurkat淋巴瘤細(xì)胞用RPMI 1640培養(yǎng)基，以密度為2×105/ml接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞處于對數(shù)生長期、密度近1×106/ml(融合度近80%)時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染 DMRIE-C脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染3條CLEC2B siRNA入Jurkat淋巴瘤細(xì)胞，采用反向轉(zhuǎn)染法[3]，轉(zhuǎn)染體系為600 μl，siRNA終濃度約80 nM，siRNA∶DMRIE-C實(shí)際配比=3 μl∶2 μl。實(shí)驗(yàn)共設(shè)定CLEC2B沉默組(沉默1組、沉默2組、沉默3組)、非沉默對照組(轉(zhuǎn)染scrambled siRNA，該siRNA無基因干擾效應(yīng)，是與目的基因序列無同源性的陰性對照siRNA序列)及空白對照組(不做任何處理)，轉(zhuǎn)染具體步驟按試劑盒說明操作。

1.2.3 CLEC2B基因沉默效率檢測 轉(zhuǎn)染后48 h，收集細(xì)胞，進(jìn)行RNA提取、cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測CLEC2B基因沉默效率。具體步驟按照試劑盒說明操作。CLEC2B上游引物5′-CCCCTATGATTGGATTGGTT-3′，下游引物5′-GGCATGTTGAGTGGAACAGT-3，產(chǎn)物大小79 bp；β-actin上游引物 5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAGT-3′，下游引物 5′-TGGGAGTTGCTGTTGAAGTC-3′，產(chǎn)物大小124 bp。應(yīng)用RG-3000熒光定量PCR儀(澳大利亞Corbett Research Sydney 公司)進(jìn)行檢測以選取沉默效率最高的CLEC2B siRNA進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 CLEC2B基因沉默后淋巴細(xì)胞增殖率檢測 實(shí)驗(yàn)分組：空白對照組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、非沉默對照組(轉(zhuǎn)染scrambled siRNA)、CLEC2B沉默組(轉(zhuǎn)染最佳CLEC2B siRNA)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。選擇基因沉默效率最高的CLEC2B siRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，MTT法測細(xì)胞增殖率，具體步驟按說明書進(jìn)行。酶標(biāo)儀在570 nm波長處測各孔的光密度(A值)。

1.2.5 sIL-2R mRNA表達(dá)水平 選擇轉(zhuǎn)染后48 h CLEC2B基因沉默率最高的轉(zhuǎn)染組，進(jìn)行RNA提取、cDNA合成及實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測sIL-2R mRNA表達(dá)情況，具體步驟按照試劑盒說明操作。實(shí)驗(yàn)分為3組：空白對照組(未進(jìn)行轉(zhuǎn)染)、非沉默對照組(轉(zhuǎn)染scrambled siRNA)、CLEC2B沉默組(轉(zhuǎn)染最佳CLEC2B siRNA)，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。sIL-2R引物經(jīng)Pubmed檢索基因序列后，由南京金瑞斯生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。sIL-2R上游引物5′-GAATTTATCATTTCGTGGTGGTCTCCG-3′，下游引物5′-TCTTCTACTCTTCCTCTGTCTCCG-3′，產(chǎn)物大小298 bp，三步法PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃變性5 s，64 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.6 結(jié)果分析 基因表達(dá)相對變化采用2-△△Ct法處理數(shù)據(jù)[4]。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)用△Ct代表基因的相對定量，Ct值代表目標(biāo)基因擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到設(shè)定閾值所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。△Ct=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，△△Ct=待測樣本△Ct-標(biāo)準(zhǔn)樣本△Ct。

2 結(jié)果

2.1 CLEC2B基因沉默效率檢測 轉(zhuǎn)染CLEC2B siRNA后，各CLEC2B沉默組較非沉默對照組CLEC2B mRNA表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各CLEC2B沉默組siRNA序列對CLEC2B基因沉默效率不等，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其中沉默2組siRNA沉默效率最高，與沉默1組和沉默3組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2 CLEC2B基因沉默后對淋巴細(xì)胞增殖率及其sIL-2R mRNA表達(dá)的影響 CLEC2B基因沉默后，空白對照組、非沉默對照組、CLEC2B沉默組淋巴細(xì)胞增殖率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組sIL-2R mRNA相對表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中CLEC2B沉默組較非沉默對照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

Table1 Comparison of CLEC2B mRNA expression quantity and slicensing effect among each group

組別CLEC2BmRNA(2-△△Ct)沉默效率(%)空白對照組1.00-非沉默對照組0.94±0.02 -沉默1組0.73±0.02*23.0±3.3△沉默2組0.61±0.03*35.0±1.9 沉默3組0.80±0.01*14.8±2.5△F值204.4089.30P值<0.01<0.01

注：與非沉默對照組比較，*P<0.05；與沉默2組比較，△P<0.05

Table2 Comparison of lymphocytes proliferation rate and sIL-2R mRNA expression among each group

組別A值sIL-2RmRNA(2-△△Ct)空白對照組0.39±0.041.00非沉默對照組0.35±0.030.87±0.04 CLEC2B沉默組0.36±0.040.34±0.03*F值1.95435.80P值>0.05<0.01

注：與非沉默對照組比較，*P<0.05

3 討論

CLEC2B基因編碼位于12號染色體12p13-p12自然殺傷(NK)細(xì)胞基因復(fù)合體區(qū)，與NKG2D、 LOX-1和Dectin-1等構(gòu)成復(fù)合體，屬于C型凝集素超家族成員，有研究顯示CLEC2B基因表達(dá)于各種血細(xì)胞[5]，并可在活化的淋巴細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄表達(dá)增加，為淋巴細(xì)胞活化后早期轉(zhuǎn)錄表達(dá)的基因[6]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RNA干擾淋巴細(xì)胞中CLEC2B基因沉默后，細(xì)胞因子sIL-2R mRNA表達(dá)下調(diào)，反之可推測，白癜風(fēng)患者體內(nèi)CLEC2B的過表達(dá)可能引起sIL-2R水平升高，這對激活NK細(xì)胞殺傷活性、活化T淋巴細(xì)胞有重要意義。與此同時(shí)，國內(nèi)外多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)IL-2、sIL-2R在白癜風(fēng)患者血清中表達(dá)升高，且與白癜風(fēng)嚴(yán)重程度相關(guān)[7]，通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步推測sIL-2R與CLEC2B參與的信號傳導(dǎo)途徑有一定相關(guān)性，參與白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制可能是：IL-2可誘導(dǎo)NK細(xì)胞增殖分化，亦可刺激NK細(xì)胞產(chǎn)生γ干擾素(INF-γ)，反之INF-γ既能活化NK細(xì)胞，又能誘導(dǎo)NK細(xì)胞表達(dá)IL-2受體，從而增強(qiáng)細(xì)胞對IL-2的反應(yīng)性。這樣，就形成一個(gè)NK細(xì)胞-IL-2-INF-γ系統(tǒng)，既可以對NK細(xì)胞的數(shù)量和功能進(jìn)行自我調(diào)節(jié)，又可以調(diào)節(jié)T、B淋巴細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞的數(shù)量和功能[8-9]。已有研究表明，NK細(xì)胞與T淋巴細(xì)胞之間存在密切的免疫相關(guān)性，多種細(xì)胞因子參與彼此之間的調(diào)節(jié)，其共同終末效應(yīng)為作用于黑素細(xì)胞，影響其存活及黑素合成功能。

本實(shí)驗(yàn)通過RNA干擾沉默CLEC2B基因，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明這直接影響了淋巴細(xì)胞sIL-2R的表達(dá)，結(jié)合本課題組既往已驗(yàn)證白癜風(fēng)患者皮損內(nèi)CLEC2B基因表達(dá)增多的現(xiàn)象，可推斷CLEC2B基因參與白癜風(fēng)發(fā)病機(jī)制可能通過影響sIL-2R等細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)，直接刺激T淋巴細(xì)胞活化分化和間接影響NK細(xì)胞的功能，最終引發(fā)黑素細(xì)胞減少白癜風(fēng)的發(fā)生，證實(shí)了CLEC2B是參與白癜風(fēng)發(fā)病的信號傳導(dǎo)途徑之一，而抑制該基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)可阻止白癜風(fēng)的病情進(jìn)展，這為白癜風(fēng)基因?qū)W及免疫學(xué)研究及白癜風(fēng)的基因治療提供了新的研究方向。目前，國內(nèi)外對CLEC2B基因的研究多集中于抗腫瘤及抗感染等領(lǐng)域，而近期，CLEC2B參與的NK細(xì)胞相關(guān)免疫機(jī)制已受到國內(nèi)外研究關(guān)注[10]，關(guān)于該基因的功能及其他相關(guān)免疫學(xué)機(jī)制還有待繼續(xù)深入研究。

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