孫曉靖，陳玉嵐，張向陽，楊少玲，黃 定，王 紅，張 宇，倪國華，趙 龍，陳 容

心肌梗死后可發(fā)生代償性的心室重構(gòu),心肌細(xì)胞凋亡可導(dǎo)致左心室舒張功能障礙,其貫穿于心肌梗死后心室肥大及心力衰竭的發(fā)展過程[1]。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物有改善心力衰竭及逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用,可誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡[2]。本研究旨在探討普伐他汀與阿托伐他汀預(yù)先干預(yù)對異丙腎上腺素急性損傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響及對凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Bax表達(dá)的影響。

1　材料與方法

1.1分組選取體質(zhì)量為(200±20) g的 140只雌性普通級SD大鼠,適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后按照隨機(jī)數(shù)字表分為6組：28只采用0.9%氯化鈉溶液灌胃(ISO組)，24只按30 mg/kg給予阿托伐他汀灌胃(L30組)，24只按10 mg/kg給予阿托伐他汀灌胃(L10組)，24只按120 mg/kg給予普伐他汀灌胃(P120組)，24只按40 mg/kg給予普伐他汀灌胃(P40組)，16只給予0.9%氯化鈉溶液灌胃(對照組)。

1.2方法每組每只大鼠每日灌胃1次，3 d后，對前5組大鼠分別皮下注射異丙腎上腺素300 mg/kg，對照組大鼠皮下注射0.9%氯化鈉溶液，分別于注射6 h和72 h時(shí)在每組大鼠中取8只進(jìn)行血流動力學(xué)監(jiān)測,同時(shí)檢測其Bcl-2和Bax的表達(dá)。

1.3血流動力學(xué)指標(biāo)測定按3 ml/kg的標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射0.3%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，將大鼠取仰臥位并適當(dāng)固定，剪毛并對右頸部術(shù)區(qū)進(jìn)行常規(guī)消毒。在術(shù)區(qū)作一大小合適的切口,分離頸總動脈并置管,連接生理記錄儀,記錄血流動力學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.4心肌組織學(xué)檢查仔細(xì)記錄壓力曲線，然后將大鼠心臟取出并洗凈，稱量濾紙吸干后的左室質(zhì)量(LVW)，以左室質(zhì)量指數(shù) (LVWI)作為左心室重塑指標(biāo)。

1.5免疫組化測定采用甲醛溶液常規(guī)固定左室心肌并進(jìn)行連續(xù)石蠟切片，脫蠟,至水,封閉內(nèi)源性過氧化物酶，采用抗原熱修復(fù),然后滴加按1∶100稀釋的一抗工作液(Santa Cruz Biotechnology，美國)，將其置于濕盒內(nèi)并放置在4 ℃冰箱過夜，PV-6001工作液在25 ℃下孵育，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，復(fù)染，脫水，透明后封片[3]。采用400倍的光鏡觀察，結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選擇5個(gè)陽性表達(dá)最強(qiáng)區(qū)的高倍視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞總數(shù),陽性表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，并求其平均值。

2　結(jié)果

2.1造模情況大鼠注射異丙腎上腺素后共死亡37只(28.9%),其中27只在第1天內(nèi)死于急性左心力衰竭(ISO組10只,阿托伐他汀組7只，普伐他汀組10只),在解剖時(shí)發(fā)現(xiàn)雙側(cè)肺淤血伴或不伴有胸腔積液,另外10只于第2天死亡(5組各2只),對照組均未死亡。

2.2心肌重塑指標(biāo)的改變與對照組比較，在注射異丙腎上腺素6 h和72 h時(shí)，其他5組大鼠體質(zhì)量均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在72 h時(shí)，ISO組、P120組及P40組的LVW和LVWI與對照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

Table1Changes of weigth and cardiac remodeling indexes after the statins intervention in the rats which isoproterenol-induced acute injury

組別只數(shù)體質(zhì)量(g)6h　　　72hLVW(mg)6h　　　72hLVWI(mg/g)6h　　　72h對照組8211±11　209±13　462±26461±42　22±02　23±01　ISO組8200±11?190±13?480±27550±61?24±02　29±03?L30組8202±11?192±10?470±47514±68　23±01　24±03　L10組8200±13?194±10?470±48513±46　24±02?24±02　P120組8202±12?190±8?469±45540±30?24±02?29±02?P40組8196±13　186±14?462±42550±82?23±01?30±02?F值4346111636685293175P值<005<005>005<005<005<005

注：與對照組比較，*P<0.05；LVW=左室質(zhì)量，LVWI=左室質(zhì)量指數(shù)

2.3血流動力學(xué)比較與對照組比較，無論在注射異丙腎上腺素后6 h時(shí)還是72 h時(shí)，其他5組大鼠心率均加快，主動脈平均壓及左室內(nèi)壓變化速率(dp/dtmax)均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表2)。

2.4Bax和Bcl-2表達(dá)的比較與對照組比較，在注射異丙腎上腺素12 h時(shí)，其他5組Bcl-2表達(dá)增高；在注射異丙腎上腺素后6 h及72 h時(shí)，其他5組大鼠Bax表達(dá)均增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在72 h時(shí)，L10組、P120組和P40組Bax/Bcl-2較對照組增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

Table3Changes of Bax,Bcl-2 expression after statins intervention in the rats which isoproterenol-induced acute injury

組別只數(shù)Bcl-2(%)6h　　　72hBax(%)6h　　　72hBax/Bcl-26h　　　72h對照組821±920±11　11±9　12±9　065±039070±039　ISO組830±941±9?39±15?57±23?129±088149±070　L30組828±944±15?27±12?48±15?100±039120±051　L10組834±1140±16?36±16?51±13?140±048160±076?P120組829±1137±20?24±10?53±19?121±076169±065?P40組831±1040±16?31±10?54±16?112±048159±064?F值241962146922932101221P值>005<005<005<005>005<005

注：與對照組比較，*P<0.05

表2　他汀類藥物干預(yù)對異丙腎上腺素急性損傷大鼠血流動力學(xué)的影響

注：與對照組比較，*P<0.05；dp/dtmax=左室內(nèi)壓變化速率

3　討論

研究證實(shí)，他汀類藥物對血管平滑肌細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡的作用，近年有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物能提高血管內(nèi)皮功能，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放氧化亞氮，增強(qiáng)冠狀動脈對二氧化氮(NO2)依賴的血管舒張及調(diào)節(jié)功能[4]。也有研究結(jié)果顯示，他汀類藥物有明顯的抗血栓形成作用，除此以外，還有顯著的抗炎作用[5]。Tanaka等[6]學(xué)者觀察到阿托伐他汀對蛋白激酶C抑制劑誘導(dǎo)培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞凋亡具有明顯的阻斷作用。Ogata等[7]在比較普伐他汀與氟伐他汀對培養(yǎng)鼠心肌細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，普伐他汀對大鼠心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用不存在明顯的時(shí)間及劑量依賴性，而氟伐他汀與普伐他汀不同，存在明顯的時(shí)間及劑量依賴性。國外有學(xué)者報(bào)道，長期服用他汀類藥物可減少心肌肥厚和纖維化，可明顯改善心功能[8]。Hasegawa等[9]觀察到對長期喂飼高鹽膳食的Dhal鹽敏感大鼠西采用立伐他汀灌胃，能顯著減輕大鼠心室肥大、心肌纖維化，同時(shí)，還可顯著減少白介素1等各種炎性遞質(zhì)的表達(dá)，保護(hù)心肌，從而避免或延緩心力衰竭的發(fā)生和發(fā)展。上述各學(xué)者研究結(jié)果各異，提示他汀類藥物作用于心肌細(xì)胞，對其凋亡的作用及影響頗為復(fù)雜[10]。

從本研究結(jié)果可以看出，在ISO組、L30組、L10組、P120組、P40組大鼠注射異丙腎上腺素6 h后，較對照組大鼠心率明顯增加，而主動脈平均壓較對照組均降低。引起這一結(jié)果的原因可能為短時(shí)間內(nèi)經(jīng)皮下大量注射異丙腎上腺素使心臟過度興奮，四肢靜脈血管擴(kuò)張明顯，大量血液滯留在外周循環(huán)血管，靜脈回心血量減少，引起心輸出量減少。但在注射異丙腎上腺素72 h后，注射異丙腎上腺素的各組大鼠與對照組比較，心率仍然加快，主動脈平均壓較6 h時(shí)有所回升，但相比對照組而言，仍然降低，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在注射異丙腎上腺素后6 h和72 h時(shí)，各組體質(zhì)量較對照組均明顯減輕；72 h時(shí)ISO組、P120組及P40組與對照組比較，LVW和LVWI均明顯增加。而L30組與L10組LVW和LVWI較對照組而言無明顯增加。與對照組比較，其與5組在注射異丙腎上腺素6 h后，Bax表達(dá)明顯增高，在72 h后Bax表達(dá)進(jìn)一步增高，L10組、P120組及P40組Bax/Bcl-2較對照組明顯增高。

1宋潔,牛凡,王偉，等.普伐他汀與阿托伐他汀對大鼠心梗后胞外基質(zhì)重構(gòu)及基質(zhì)金屬蛋白酶的影響[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2007,23(6):673-675,678.

2張巍,趙明,王小鳳，等.大劑量阿托伐他汀對急性心肌梗死行急診PCI患者心肌再灌注損傷的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2011,38(21):4545-4547.

3吳志勇,漆紅梅,盛國太，等.氟伐他汀對心肌梗死后大鼠心肌細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)及心室重塑的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2011,31(13):2487-2489.

4Sanguigni V,Pignatelli P,Lenti L,et al.Short-term treatment with atorvastat in reduces platelet CD40 ligand and thrombin generation in hyper cholesterolemic patients[J].Circulation,2005,111(4):412-419.

5周平,李法琦,張彬，等.辛伐他汀對高脂血癥大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)凋亡的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2010,30(11):1545-1548.

6Tanaka K,Honda M,Takabatake T.Anti-apoptotic effect of atorvastatin,a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme a reductase inhibitor,on cardiac myocytes through protein kinase C activation[J].Clin Exp Pharmacol Physiol,2004,31(5/6):360-364.

7Ogata Y,Takahashi M,Takeuchi K,et al.Fluvastatin induces apoptosis in rat neonatal cardiac myocytes:a possible mechanism of statin-attenuated cardiac hypertrophy[J].J Cardiovasc Pharmacol,2002,40(6):907-915.

8Erl W,Hristov M,Neureuter M,et al.HMG-CoA reductase inhibitors induce apoptosis in neointima-derived vascular smooth muscle cells[J].Atherosclerosis,2003,169(2):251-258.

9Hasegawa H,Yamamoto R,Takano H,et al.3-Hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitors prevent the development of cardiac hypertrophy and heart failure in rats[J].J Mol Cell Cardiol,2003,35(8):953-960.

10陳海榮.阿托伐他汀對急性心肌梗死患者血清高敏C-反應(yīng)蛋白的影響[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2011,38(18):3814-3815.