侯國芳，劉 艷，張霄蓓，劉晶晶，張 晟，張 瑾

1997年John Dick等人首次提出急性髓性白血病的發(fā)生、發(fā)展是由于一些具有自我更新、多系分化以及有成瘤能力的細胞所造成的，并將其命名為干細胞(CSCs)[1]。隨后，2003年Al-Hajj等[2]采用CD44+CD24-/lowlin-表面標記分子分離出乳腺癌干細胞。鑒于腫瘤干細胞特殊的地位，其治療成為當前研究的熱點。隨著醫(yī)學的不斷發(fā)展，癌癥的治療手段呈現(xiàn)多樣化和規(guī)范化的趨勢。在手術、化療、放療為主要治療手段的大背景下，光動力療法(PDT)近年逐漸進入人們的視野，其突出優(yōu)點體現(xiàn)在無創(chuàng)性消滅局部腫瘤病灶，不良反應小，可重復性高，但其對腫瘤干細胞是否具有抑制作用，尚未可知?；诖四康模狙芯坎捎肞DT作用于MCF-7乳腺癌干細胞，通過檢測生長濃度抑制曲線和分析細胞凋亡圖形，探索PDT對腫瘤干細胞的作用。

1　對象與方法

1.1研究對象人MCF-7乳腺癌細胞系為天津市腫瘤醫(yī)院公共實驗室所保存。

1.2試劑光敏劑血卟啉單甲醚(HMME)購于上海先輝醫(yī)藥科技有限公司。RPMI1640、胎牛血清(FCS)、Hank′s液、四甲基偶氮唑鹽(MTT)、胰酶、B27、DMEM購于GIBCO公司；分選熒光抗體購于SANTA CRUZ生物科技公司；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自KeyGEN公司；胰島素購于sigma公司；表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)購于Reprotech公司。其他試劑均由天津市腫瘤醫(yī)院公共實驗室提供。

1.3實驗儀器37 ℃自動CO2恒溫培養(yǎng)箱；無菌超凈臺；He-Ne激光器；酶聯(lián)免疫檢測儀、流式細胞儀等儀器由天津市腫瘤醫(yī)院公共實驗室提供。

1.4實驗方法

1.4.1細胞培養(yǎng)及流式方法分選MCF-7乳腺癌干細胞將MCF-7細胞置于25 cm2培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%FCS的RPMI1640。1～2 d換液，細胞長至80%左右進行傳代，置于37 ℃，5%CO2飽和濕度孵化箱進行培養(yǎng)。取對數(shù)期生長MCF-7細胞，0.25%胰酶消化。終止消化后，1 000 r/m，5 min離心，離心半徑為15 cm,Hank′s液沖洗2遍。用Hank′s液重懸后吹成單細胞懸液，分裝于5個流式管，采用CD24-PE、CD44-APC、ESA-FITC抗體選取表面標記為CD44+CD24-/lowESA+細胞。分選出的腫瘤干細胞采用含有EGF 20 μg/L、bFGF 10 μg/L、胰島素5 mg/L和B27(1∶50)的DMEM-F12培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.4.2MTT試驗取對數(shù)期生長MCF-7細胞，0.25%胰酶消化，終止消化后收集細胞。同時收集經(jīng)過流式篩選的表型為CD44+CD24-/lowESA+MCF-7乳腺癌干細胞。二者分別分為4組，即空白對照組、單純照射組、單純光敏劑組和PDT組。空白對照組不經(jīng)過任何處理，單純照射組僅采用激光照射，光照強度為5 J/cm2。單純光敏劑組僅加入濃度為40 μg/ml的光敏劑避光孵育2 h。而PDT組加入濃度為40 μg/ml的光敏劑避光孵育2 h，PBS沖洗后分別加入新鮮的細胞培養(yǎng)液，再采用光照強度為5 J/cm2進行照射。照射波長為632.8 nm，激光功率密度為10 mW/ cm2，照射時間為5 min。

PDT整體過程均需避光操作。HMME孵育液采用DMEM液配制成所需濃度。MTT設置5個復孔，同時設置調(diào)零孔和對照孔，邊緣空用無菌PBS填充。將分選后的MCF-7乳腺癌干細胞置于96孔板中，經(jīng)過上述試驗處理后孵育24 h。每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37 ℃，5%CO2飽和濕度孵化箱繼續(xù)孵育4 h。將上清液離心去除，每孔二甲基亞砜(DMSO)150 μl重懸，搖床上震蕩10 min，酶聯(lián)免疫吸附儀上檢測各孔的光吸收值(OD值)，計算生長抑制率。試驗重復3次。MCF-7乳腺癌細胞處理方式近似，在去除MTT溶液時不需要離心，直接吸除上清即可。

1.4.3細胞凋亡按照上述過程對MCF-7乳腺癌干細胞用干細胞培養(yǎng)液重懸后置于35 mm培養(yǎng)皿中，分為空白對照組、單純光照組、單純光敏劑組和PDT組?？瞻讓φ战M加入0.5%DMSO。單純照射組僅采用激光照射，光照強度為5 J/cm2。單純光敏劑組僅加入濃度為40 μg/ml的光敏劑避光孵育2 h。PDT組加入40 μg/ml光敏劑避光孵育2 h。PBS沖洗后加入新鮮干細胞培養(yǎng)液，置于5.0 J/cm2能量密度下進行照射。經(jīng)過試驗處理后孵育24 h，收集細胞，加入Annexin V-FITC和propidium iodide 各5 μl，室溫、避光條件下孵育15 min后，上機檢測細胞凋亡率。

2　結果

2.1MCF-7乳腺癌干細胞比例試驗通過流式分選得到CD44+CD24-/lowESA+表型MCF-7乳腺癌干細胞所含比例為(1.2±0.4)%(見圖1)。

圖1　MCF-7乳腺癌干細胞比例

2.2MTT試驗結果空白對照組、單純照射組、單純光敏劑組及PDT組MCF-7乳腺癌干細胞生長抑制率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中PDT組較空白對照組、單純照射組、單純光敏劑組均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M、單純照射組、單純光敏劑組及PDT組未分選MCF-7乳腺癌干細胞生長抑制率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中PDT組較空白對照組、單純照射組、單純光敏劑組均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?？瞻讓φ战M、單純照射組及PDT組MCF-7乳腺癌干細胞與未分選MCF-7乳腺癌干細胞采用生長抑制率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡空白對照組、單純照射組、單純光敏劑組與PDT組MCF-7乳腺癌干細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中PDT組較空白對照組、單純照射組、單純光敏劑組均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、圖2)。

注A=空白對照組，B=單純光照組，C=單純光敏劑組，D=PDT組

圖2不同治療方法對MCF-7乳腺癌干細胞凋亡的影響

Figure2Apoptosis of MCF-7 breast cancer stem cells with different treatment

Table1Inhibitory effects of photodynamic therapy on unsorted MCF-7 breast cancer cells and breast cancer stem cells

組別MCF-7乳腺癌干細胞未分選MCF-7乳腺癌干細胞t值P值空白對照組　40±05?　103±25?　4275　0013單純照射組　97±04?　198±14?11667<0001單純光敏劑組　75±05?　150±50?　2587　0061PDT組469±04　512±11　64640003F值594361187P值<0001<0001

注：與PDT組比較，*P<0.05

Table2Comparison of apoptosis of MCF-7 breast cancer stem cells with different treatment

組別凋亡率空白對照組　135±009?　單純照射組　328±060?　單純光敏劑組　208±039?　PDT組1348±022　F值67682P值<0001

注：與PDT組比較，*P<0.05

3　討論

由于乳腺癌干細胞特殊的性質(zhì)，其對化療、放療、內(nèi)分泌治療均存在一定程度的耐受[3-5]。PDT最為近年來新興的一種無創(chuàng)性治療手段，其對乳腺癌干細胞是否具有作用報道較少。本研究選取乳腺癌干細胞為研究對象，通過檢測生長濃度抑制曲線和分析細胞凋亡圖形，檢測了光動力的治療作用。

研究顯示無論是未分選MCF-7乳腺癌干細胞還是分選出的腫瘤干細胞，不同處理組組間的抑制作用均具有差異，PDT組的抑制率均明顯高于其他幾組。但是相同光敏劑濃度和光照強度下，未分選MCF-7乳腺癌干細胞受抑制更明顯。該結論同之前的研究結果相似，乳腺癌干細胞對多種治療方式均存在耐受現(xiàn)象[3-5]。HMME作為我國研制的第二代光敏劑，臨床試驗已經(jīng)證實了其對惡性消化道腫瘤的治療作用[6]。體外實驗發(fā)現(xiàn)其對乳腺癌細胞也具有抑制作用[7-8]。從本研究結果來看，雖然HMME PDT體現(xiàn)了對MCF-7乳腺癌干細胞的抑制作用，但仍然不可避免的存在耐受。研究人員認為腫瘤干細胞對化療的耐受與ABCG2將化療藥物轉運出細胞有密切關系[9]。光敏劑作為一種化學物質(zhì)，是否ABCG2也將其轉運出細胞從而影響其作用效果？研究顯示結腸癌細胞系ABCG2表達影響了金絲桃素介導的光動力效應的發(fā)揮[10]。同樣，肺癌細胞也存在類似的現(xiàn)象[11]。此外，皮膚角質(zhì)細胞在加入ABCG2抑制劑后，其對光動力治療的敏感性顯著提高[12]。這些研究結果提示我們?nèi)橄侔└杉毎麑鈩恿χ委煹哪褪苄砸部赡芘cABCG2表達有關。因此今后的研究可以聯(lián)合抑制ABCG2表達或作用的藥物，以期進一步提高治療效果。

雖然光動力治療對乳腺癌干細胞的作用并未展現(xiàn)出絕對的優(yōu)勢，但是仍然顯示了一定的療效。其作用方式究竟是直接殺傷還是誘導凋亡？本研究認為光動力治療對乳腺癌干細胞的抑制作用主要是通過誘導細胞凋亡來實現(xiàn)的。Annexin V/PI雙染結果顯示光動力治療組乳腺癌干細胞凋亡率明顯高于對照組。Liu等[7]選取犬乳腺癌細胞及光敏劑HMME作為研究對象，結果顯示光動力治療以誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡為主。此外，以其他物質(zhì)作為光敏劑的光動力治療結果也支持該結果。但是否由caspase家族始動凋亡過程，目前報道尚未達成一致?？赡芘c選擇光敏劑種類不同或細胞定位不同有關[13-16]。因此，進一步研究應當檢測光敏劑細胞定位及凋亡相關因子。

綜上所述，PDT對乳腺癌干細胞具有一定程度的抑制作用，但是仍然存在耐受。其抑制乳腺癌干細胞生長的機制可能與誘導細胞凋亡有關，但確切機制仍需進一步檢測凋亡相關因子等來驗證。耐受的原因可能與ABCG2高表達有關，可以聯(lián)合相關藥物以提高療效。

1　Bonnet D,Dick JE.Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell[J].Nat Med,1997，3(7):730-737.

2Al-Hajj M,Wicha MS,Benito-Hernandez A,et al.Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(7):3983-3988.

3Lagadec C,Vlashi E,Della Donna L,et al.Survival and self-renewing capacity of breast cancer initiating cells during fractionated radiation treatment[J].Breast Cancer Res,2010,12(1):R13.

4Creighton CJ,Li X,Landis M,et al.Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features[J].Proc Natl Sci USA,2009,106(33):13820-13825.

5Li X,Lewis MT,Huang J，et al.Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy[J].J Natl Cancer Inst,2008,100(9):672-679.

6劉慧龍，劉端祺，介雅慧,等.三種光敏劑介導的光動力療法治療上消化道腫瘤的療效比較研究[J].中國激光醫(yī)學雜志,2011,20(6):359-365.

7Liu Y,Ma XQ,Jin P,et al.Apoptosis induced by hematoporphyrin monomethyl ether combined with He-Ne laser irradiation in vitro on canine breast cancer cells[J].Vet J,2011,188(3):325-330.

8陰慧娟，李曉原，劉建中,等.以532nm激光為光源的HMME-PDT對人類乳腺癌細胞的殺傷作用[J].中國醫(yī)學物理學雜志,2006，23(4):258-261.

9Nguyen NP,Almeida FS,Chi A,et al.Molecular biology of breast cancer stem cells:potential clinical applications[J].Cancer Treat Rev,2010,36(6):485-491.

10 An R,Hagiya Y,Tamura A,et al.Cellular phototoxicity evoked through the inhibition of human ABC transporter ABCG2 by cyclin-dependent kinase inhibitors in vitro[J].Pharm Res,2009,26(2):449-458.

11 Usuda J,Ichinose S,Ishizumi T,et al.Molecular determinants of photodynamic therapy for lung cancers[J].Lasers Surg Med,2011,43(7):591-599.

12 Bebes A,Nagy T,Bata-Cs?rgo Z,et al.Specific inhibition of the ABCG2 transporter could improve the efficacy of photodynamic therapy[J].J Photochem Photobiol B,2011,105(2):162-166.

13 Li B,Chu X,Gao M,et al.Apoptotic mechanism of MCF-7 breast cells in vivo and in vitro induced by photodynamic therapy with C-phycocyanin[J].Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai),2010,42(1):80-89.

14 Vittar NB,Awruch J,Azizuddin K,et al.Caspase-independent apoptosis,in human MCF-7c3 breast cancer cells,following photodynamictherapy,with a novel water-soluble phthalocyanine[J].Int J Biochem Cell Biol,2010,42(7):1123-1131.

15 Sarrazy V,Garcia G,MBakidi JP,et al.Photodynamic effects of porphyrin-polyamine conjugates in human breast cancer and keratinocyte cell lines[J].J Photochem Photobiol B,2011,103(3):201-206.

16 Hoi SW,Wong HM,Chan JY,et al.Photodynamic therapy of Pheophorbide a inhibits the proliferation of human breast tumour via both caspase-dependent and-independent apoptotic pathways in in vitro and in vivo models[J].Phytother Res,2012,26(5):734-742.