吳廣飛，張運(yùn)捷，劉博偉，陸 強(qiáng)，尹福在，陳莉明

糖尿病腎病(DN)是糖尿病(DM)最常見的微血管并發(fā)癥之一，其發(fā)病機(jī)制還不很清楚。正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的活性調(diào)節(jié)蛋白(RANTES)屬于趨化因子家族，RANTES在體內(nèi)分布廣泛，腎臟系膜細(xì)胞及腎小管上皮細(xì)胞等均可產(chǎn)生RANTES,趨化單核-巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞炎癥和免疫反應(yīng)，參與腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。RANTES基因啟動(dòng)子存在-403G/A突變，已證實(shí)基因突變提高了基因表達(dá)水平[1]，其與DN的相關(guān)研究國內(nèi)外報(bào)道較少。本研究對(duì)中國天津地區(qū)漢族人群中RANTES基因啟動(dòng)子-403G/A變異進(jìn)行基因分型，探討其與2型糖尿病(T2DM)并發(fā)DN風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1　對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象選取2004年6—10月天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院住院的T2DM患者 244例為研究對(duì)象，其中男118例，女126例；年齡36～82歲，平均(62.3±9.9)歲；體質(zhì)指數(shù)(BMI)(24.5±3.2)kg/m2。T2DM診斷依據(jù)1999年世界衛(wèi)生組織(WHO)DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。DM診斷病程均在8年以上，血漿肌酐水平<1.5 mg/dl(133 μmol/L)。排除糖尿病急性并發(fā)癥、合并感染、繼發(fā)性糖尿病，據(jù)病史排除原發(fā)性腎小球腎炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、藥源性間質(zhì)性腎炎、慢性腎盂腎炎等腎臟疾病，B超排除多囊腎。依據(jù)2～6個(gè)月內(nèi)至少兩次24 h尿清蛋白排泄率(AER)水平，分為3組：<20 μg/min為正常清蛋白尿組(DN0組)；20～200 μg/min為微量清蛋白尿組(DN1組)；>200 μg/min為臨床清蛋白尿組(DN2組)。

1.2方法

1.2.1病史詢問及體格檢查由專人對(duì)受試者進(jìn)行詳細(xì)病史詢問并填表，空腹測量身高、體質(zhì)量、收縮壓(SBP)及舒張壓(DBP),并計(jì)算BMI，記錄血總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、纖維蛋白原(FIB)及糖化血紅蛋白(HbA1c)水平。

1.2.2受試者基因組DNA提取應(yīng)用蛋白酶K快速裂解消化法提取基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度法測定OD值，計(jì)算DNA濃度。

1.2.3RANTES基因啟動(dòng)子-403G/A多態(tài)性測定RANTES基因啟動(dòng)子-403G/A上游引物為5′-CACAAGAGGACTCATTCCAACTCA-3′；下游引物為5′-GTTCCTGCTTATTCATTACAGATCgTA-3′(g引入酶切消化位點(diǎn))，由Takara公司合成(PAGE純化，純度>99%)。限制性核酸內(nèi)切酶(RsaⅠ)購自美國Promega公司，由北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司代理,RsaⅠ識(shí)別序列：5′…GT▼AC…3′、3′…CA▼TG…5′，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)體外擴(kuò)增目的基因片斷，反應(yīng)體系25 μl，反應(yīng)參數(shù)如下：94 ℃預(yù)變性5 min，然后94 ℃變性30 s、59 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。酶切反應(yīng)體系20 μl，將反應(yīng)體系充分混勻，37 ℃水浴反應(yīng)120 min后，2.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定酶切產(chǎn)物。選取應(yīng)用RFLP鑒定的RANTES-403G/A基因型為GG、GA、AA的DNA模板，分別擴(kuò)增90 μl的PCR產(chǎn)物，送至上海申能博彩生物科技有限公司純化、直接測序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料采用One-Sample K-S test 檢驗(yàn)正態(tài)分布，3組間比較用方差分析(ANOVA)及LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較；計(jì)數(shù)資料采用R×Cχ2檢驗(yàn)，組間比較應(yīng)用χ2分割法；采用Logistic逐步回歸分析DN的危險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定OD260/OD280>1.6，說明DNA的純度好，計(jì)算DNA的濃度在200 ng/μl左右。應(yīng)用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳可見，目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物較好(見圖1)。

2.2PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的RFLP鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)RsaⅠ消化后，G/G基因型酶切后產(chǎn)生180 bp和20 bp的片斷，G/A基因型酶切后產(chǎn)生206 bp、180 bp和20 bp的片斷，A/A基因型酶切后仍為206 bp。20 bp的片斷太小，凝膠中未見到(見圖2)。

2.33組間一般情況及生化指標(biāo)比較3組間性別構(gòu)成、年齡、BMI、HbA1c、TG水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。DN1組病程、SBP、DBP水平高于DN0組，HDL-C水平低于DN0組；DN2組SBP、DBP、LDL-C、FIB水平高于DN0和DN1組，DN2組病程高于DN0組，DN2組TC、HDL-C水平高于DN1組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1　3組一般情況及生化指標(biāo)比較

注：BMI=體質(zhì)指數(shù)，HbA1c=糖化血紅蛋白，SBP=收縮壓，DBP=舒張壓，TC=總膽固醇，TG=三酰甘油，LDL-C=低密度脂蛋白膽固醇，HDL-C=高密度脂蛋白膽固醇，F(xiàn)IB=纖維蛋白原；與DN0比較，*P<0.05；與DN1比較，△P<0.05；▲為χ2值

注：1～7為目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物206 bp，8為100 bp DNA Ladder Marker

圖1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1.5%的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Figure1Result of PCR amplification product by 1.5% agarose gel electrophoresis

注：1、2電泳條帶為206 bp,基因型為RANTES-403A/A；3、4電泳條帶為206 bp、180 bp,基因型為RANTES-403G/A；5、6電泳條帶為180 bp,基因型為RANTES-403G/G；7為100 bp DNA Ladder Marker

圖2酶切產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

Figure2Result of enzyme product by 2.5% agarose gel electrophoresis

2.43組基因型及等位基因頻率比較3組基因型及等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg定律。DN0組、DN1組及DN2組基因型頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.801,ν=4,P=0.040)。組間比較應(yīng)用R×C分割法,DN0與DN1組基因型頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.705,ν=2,P=0.426)。將DN0與DN1組合并，與DN2組基因型頻率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.245,ν=2,P=0.016，見表2)。

DN0組、DN1組及DN2組等位基因頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.613,ν=2,P=0.022)。組間比較應(yīng)用R×C分割法,DN0與DN1組等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.066,ν=1,P=0.798)。將DN0與DN1組合并,A等位基因頻率低于DN2組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.552,ν=1,P=0.006，見表2)。

2.5DN危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析DN0組為無DN組,DN1+DN2組為有DN組,以RANTES-403G/A的基因型、性別、病程、SBP、DBP為自變量,以有無DN為因變量,進(jìn)行Logistic回歸分析,結(jié)果顯示RANTES-403A(+)的基因型、病程、SBP與T2DM并發(fā)DN有回歸關(guān)系(見表3)。

表23組基因型及等位基因頻率比較〔n(%)〕

Table2Comparison of respective frequency of genotype and allele in the three groups

組別例數(shù)基因型頻率GG　　　　GA　　　　AA等位基因頻率G　　　　　　　ADN08651(593)23(267)12(140)125(727)47(273)DN18445(536)30(357)　9(107)　120(714)48(286)DN27427(365)34(459)13(176)　88(595)　60(405)

表3　DN危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析結(jié)果

3　討論

炎癥反應(yīng)參與了DN的病理生理過程，有研究顯示，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)及血管緊張素受體阻斷劑(ARB)具有抗炎作用，可抑制某些炎性因子，如單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)及RANTES表達(dá)，甚至逆轉(zhuǎn)Ⅲ期DN，但由于缺乏有針對(duì)性的抗炎治療，Ⅳ期DN尚無有效藥物治療，仍有20%Ⅳ期DN患者發(fā)展至終末腎衰竭(EASD)[2]。

RANTES屬于趨化因子家族，在低濃度水平時(shí)，即具有典型的趨化作用，通過G蛋白偶聯(lián)受體介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，使單核細(xì)胞、T細(xì)胞等沿其濃度梯度遷移，在高濃度水平時(shí),還可通過蛋白酪氨酸(PTK)介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，RANTES還可激活JAK、p38MAP激酶，上調(diào)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。

RANTES啟動(dòng)子區(qū)存在-403G/A、-28C/G兩個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，已證實(shí)，基因突變?cè)黾恿薘ANTES的表達(dá)水平[1]，有研究顯示，Ⅲ期DN患者尿液MCP-1和RANTES水平均提高，且RANTES水平與HbA1c相關(guān)[4]，高血糖可以通過糖基化終末產(chǎn)物刺激RANTES表達(dá)。Mezzano等[5]通過腎活檢研究了11例Ⅳ期DN患者，觀察到了MCP-1和RANTES表達(dá)上調(diào)，主要在腎小管細(xì)胞，而且，在同樣的細(xì)胞，MCP-1和RANTES上調(diào)與核因子κB(NF-κB)的活性密切相關(guān)。另外，腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)MCP-1和RANTES與蛋白尿量和腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤程度密切相關(guān)。

DN大鼠實(shí)驗(yàn)同樣發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)了腎損傷，巨噬細(xì)胞的募集和激活與高血糖及HbA1c、清蛋白尿和血肌酐水平升高有關(guān)，與系膜細(xì)胞MCP-1、RANTES、遷移抑制因子(MIF)、單核細(xì)胞單克隆刺激因子表達(dá)有關(guān),巨噬細(xì)胞參與了腎小球的硬化，促進(jìn)了DN的進(jìn)展[6]。

日本學(xué)者Nakajima等[7]應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制片斷長度多態(tài)性(PCR-RFLP)法首次對(duì)RANTES基因啟動(dòng)子區(qū)-403G/A、-28C/G兩個(gè)位點(diǎn)基因多態(tài)性與T2DM并發(fā)DN的關(guān)系進(jìn)行了研究,結(jié)果顯示RANTES啟動(dòng)子-403G/A基因多態(tài)性與DN無關(guān)，-28 G(+)的基因型與DN有關(guān)，可能是DN的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Nakajima在研究對(duì)象的入選上沒有限制病程，大量清蛋白尿組病程高于微量清蛋白尿和正常清蛋白尿組，但研究對(duì)象616例，考慮到微量清蛋白尿組患者由于血壓和血糖的暫時(shí)影響，一部分患者可能進(jìn)入正常清蛋白尿組和大量清蛋白尿組，正常清蛋白尿組由于病程的影響，一部分患者可能進(jìn)入微量清蛋白尿組，Nakajima剔除微量清蛋白尿組，限定病程>10年的患者，進(jìn)行正常清蛋白尿組和大量清蛋白尿組的比較，得出了相同的結(jié)論。

本研究結(jié)果顯示，RANTES啟動(dòng)子-403G/A基因多態(tài)性與DN存在關(guān)聯(lián)性，DN0組、DN1組及DN2組間無論是GG、GA、AA基因型頻率之間還是A(+)的基因型與A(-)的基因型頻率之間均有差異，這與Nakajima的結(jié)果不一致，可能由于基因分布的種族差異、研究對(duì)象的入選及其他未知因素所致。進(jìn)行組間比較時(shí)，DN0組與DN1組比較無差異，另外，DN0組中部分患者可能處于DNⅠ期或Ⅱ期，進(jìn)行了DN0組與DN1組的合并，與DN2組比較，得出了相同的結(jié)論。李會(huì)芳等[8]探討了RANTES基因啟動(dòng)子區(qū)-28C/G基因多態(tài)性與中國昆明地區(qū)漢族人DN的相關(guān)關(guān)系，結(jié)果顯示-28G等位基因頻率在對(duì)照組、正常清蛋白尿組、微量清蛋白尿組及大量蛋白尿組中分別為6.0%、7.8%、8.6%和8.6%,得出此位點(diǎn)與DN不相關(guān)的結(jié)論，這與Nakajima的結(jié)果也不一致。然而，張松等[9]研究T2DM 143例，結(jié)果顯示RANTES基因啟動(dòng)子-28G陽性基因型與DN相關(guān)，與Nakajima的結(jié)果一致。由于-28G等位基因頻率在中國人群中的分布較低，擴(kuò)大樣本研究結(jié)果更可靠。Joo等[10]研究了177例DN患者，結(jié)果卻顯示RANTES啟動(dòng)子-403G/A、-28C/G基因多態(tài)性與DN均無關(guān)聯(lián)性。

許多研究已經(jīng)證實(shí)，高血糖、高血壓、微量清蛋白尿、病程、年齡、男性、吸煙及遺傳因素等是DN的危險(xiǎn)因素,為了避免由于病程引起的偏倚，本研究所選病例病程均>8年，但DN1組、DN2組病程高于DN0組，可見，隨病程延長，DN可能加重。有研究證實(shí)，微量清蛋白尿是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，本研究提示，隨著DN進(jìn)展，血壓、血脂控制更差，增加了動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展。本研究樣本小，所選T2DM患者僅代表住院患者，結(jié)果有一定局限性，今后仍需擴(kuò)大樣本進(jìn)一步研究。另外，同時(shí)檢測血、尿RANTES水平更有意義?？寡字委熡型蔀橹委烡N的一種新的手段,RANTES單克隆抗體、基因敲除及反義寡核苷酸技術(shù)的應(yīng)用，使針對(duì)RANTES的治療可能成為治療DN的有效手段。

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