徐 瑞，張愛平

腎小球疾病是最常見的疾病之一，是導(dǎo)致終末期腎病的最主要病因。血紅素氧合酶(HO)是血紅素降解為膽綠素、一氧化碳(CO)和Fe2+的起始酶和最為重要的限速酶，血紅素氧合酶-1(HO-1)是其誘導(dǎo)型，對于腎臟來說是一種細胞保護因子，能抑制甚至逆轉(zhuǎn)腎小管間質(zhì)纖維化[1]。本研究通過檢測原發(fā)性腎小球疾病患者腎組織和尿液中HO-1的表達，分析其與患者臨床特征的關(guān)系，為腎小球疾病腎間質(zhì)纖維化的防治提供理論依據(jù)。

1　資料與方法

1.1一般資料選擇2012年11月—2013年3月在我院住院并通過臨床表現(xiàn)及腎活檢確診的原發(fā)性腎小球疾病患者33例為病例組，其中男20例，女13例；年齡17～61歲，平均(38.7±15.1)歲；病程10 d～107個月。臨床診斷：腎病綜合征13例，慢性腎炎15例，隱匿性腎炎5例。病理診斷〔根據(jù)1995年世界衛(wèi)生組織(WHO)腎臟病組織學(xué)分類標準〕：IgA腎病11例，系膜增生性腎小球腎炎10例，膜性腎病9例，膜增生性腎小球腎炎3例。所有患者在腎活檢前未使用糖皮質(zhì)激素、細胞毒藥物等，并排除繼發(fā)性慢性腎臟疾病如糖尿病腎病、紫癜性腎炎、狼瘡性腎炎、乙型肝炎相關(guān)性腎炎等。所有患者知情同意，腎活檢前簽署知情同意書。所有患者腎活檢前腎功能指標：平均動脈壓(MAP)為(103.45±11.80)mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，尿比重(SG)為(1.019±0.012)，血清清蛋白(ALB)為(32.57±12.48)g/L，血肌酐(Scr)為(115.87±27.04)μmol/L，尿素氮(BUN)為(5.45±1.96)mmol/L，血尿酸(UA)為(326.35±79.30)μmol/L，24 h尿蛋白定量為(1.79±1.25)g，通過簡化MDRD公式估測的腎小球濾過率(eGFR)為(70.62±28.18)ml·min-1·(1.73 m2)-1。

采用單純隨機抽樣法選取同期在我院健康體檢正常者10例為對照組，其中男5例，女5例；年齡19～52歲，平均(36.4±12.9)歲。對照組受檢者的年齡、性別均與病例組患者相匹配，均無糖尿病、高血壓、乙型肝炎、結(jié)核及心腎疾病史等。

1.2腎小管間質(zhì)損害程度根據(jù)Katafuchi等[2]制定的腎小管間質(zhì)損害程度分級標準，采用半定量積分法判斷腎小管間質(zhì)損害程度，共包括間質(zhì)炎性細胞浸潤、間質(zhì)纖維化及腎小管萎縮3項，每項0～3分，總分0～9 分。無病變計0分，病變占皮質(zhì)腎組織面積的0～25%計1分，26%～50%計2分，>50%計3分。根據(jù)腎小管間質(zhì)損害程度將病例組分為4個亞組：A組(總分0分)8例，B組(總分1～3分)11例，C組(總分4～6分)9例，D組(總分7～9分)5例。

1.3尿標本收集所有受檢者于腎活檢前留取晨尿10 ml，500 r/min離心5min，棄上清液，取尿沉渣于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4檢查方法

1.4.1腎組織活檢(1)光鏡：常規(guī)石蠟包埋，切片(厚度為2 μm)，行蘇木素-伊紅染色(HE染色)、高碘酸-席夫染色(PAS染色)、馬松三色染色(Masson染色)、六胺銀染色(PASM染色)。免疫熒光(IF)：腎組織冷凍切片(厚度為4 μm)，直接免疫熒光法(DIF)檢測免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)、補體C3、補體C1q、纖維蛋白相關(guān)抗原(FRA)；間接免疫熒光法(IIF)檢測乙肝病毒核心抗原(HBcAg)和乙肝病毒表面抗原(HBsAg)，一抗和二抗均購自丹麥Dako公司。熒光強度分級：0級(-)：低倍鏡下不顯示或高倍鏡下隱約可見；1級(+)：低倍鏡下隱約可見，高倍鏡下可見；2級(++)：低倍鏡下可見，高倍鏡下清晰可見；3級(+++)：低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼；4級(++++)：低倍鏡下耀眼，高倍鏡下刺眼。光鏡和免疫熒光結(jié)果的觀察均使用Leica圖像成像處理系統(tǒng)。

1.4.2腎組織HO-1的表達采用IIF進行檢測：將4 μm厚新鮮冷凍腎組織切片置于載玻片上，避光環(huán)境下滴加兔抗人HO-1多克隆抗體(1∶250，購自美國ABCAM公司，批號ab52947)后放入濕盒，37 ℃孵育1 h，磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)沖洗后滴加異硫氰熒光素(FITC)標記的山羊抗兔IgG抗體(1∶50，購自北京康為世紀生物科技有限公司，批號CW0114)，37 ℃孵育10 min，PBS緩沖液沖洗后置于熒光顯微鏡下觀察，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4.3尿HO-1的表達采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)進行檢測：將留取的尿沉渣常溫復(fù)溫30 min，于人HO-1 ELISA試劑盒(購自河北博海生物工程開發(fā)有限公司)待測樣品孔加入尿沉渣40 μl(以PBS緩沖液稀釋3倍)、抗HO-1抗體10 μl、鏈霉親和素-HRP 50 μl，37 ℃溫育1 h，洗滌液洗板5次，拍干后加入顯色劑A 50 μl、顯色劑B 50 μl，37 ℃避光顯色10 min，加入終止液50 μl，以色譜酶標儀于450 nm波長下讀取吸光度值(OD值)。根據(jù)標準品濃度及OD值計算標準曲線，進一步計算得出尿沉渣HO-1表達水平。

2　結(jié)果

2.1腎組織HO-1的表達及臨床指標比較PBS緩沖液代替一抗作陰性對照的腎組織無HO-1陽性表達，B組和C組患者腎組織HO-1表達陽性，且均在腎小管表達(見圖1)。亞組分析結(jié)果顯示，4組患者腎組織HO-1表達強度、半定量積分總分、MAP、BUN、Scr、SG、eGFR比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.2尿HO-1的表達對照組尿HO-1表達水平為(145.90±55.27)ng/L，病例組為(207.83±62.51)ng/L，病例組尿HO-1表達水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.813，P=0.007)。亞組分析結(jié)果顯示，4組患者尿HO-1表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3相關(guān)性分析Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，腎組織HO-1表達強度與半定量積分總分呈負相關(guān)，與eGFR呈正相關(guān)，與其他變量無直線相關(guān)性(見表2)；Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，尿HO-1表達水平與半定量積分總分呈正相關(guān)，與其他變量無直線相關(guān)性(見表3)。

表1　各亞組腎組織和尿液HO-1的表達及臨床指標分析結(jié)果比較

注：與A組比較，*P<0.05；與B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05;eGFR=估測的腎小球濾過率

注：A：表達強度(±)，B：表達強度(+)，C：表達強度(++)

圖1　HO-1在原發(fā)性腎小球疾病患者腎組織的表達(間接免疫熒光，×400)

表3　尿HO-1表達水平與其他變量的相關(guān)性分析

3　討論

HO是人類和哺乳動物體內(nèi)廣泛存在的一種氧合酶，能夠分解血紅素，產(chǎn)生等摩爾的膽紅素、CO和Fe2+，有著十分重要的生物學(xué)作用[3]。HO的同工酶有3種形式：HO-1、血紅素氧合酶-2(HO-2)和血紅素氧合酶-3(HO-3)。HO-1是HO的誘導(dǎo)型，又稱熱休克蛋白32(HSP 32)，主要分布在組織細胞微粒體內(nèi)。HO-1是反映細胞氧化損傷最敏感的指標之一[4]，在感染、缺氧、損傷等多種刺激下可在短期內(nèi)被誘導(dǎo)高表達[5]，參與包括呼吸系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌以及腎臟系統(tǒng)等多系統(tǒng)疾病的發(fā)生和發(fā)展[1，6]，發(fā)揮抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡、抑制黏附分子表達和改善組織微循環(huán)等作用。

正常情況下，腎臟可低水平表達HO-1，雖然其在腎臟皮質(zhì)的近端小管、遠端小管，髓質(zhì)的集合管、髓袢上皮細胞內(nèi)均可表達[7]，但HO-1主要在腎小管表達，當腎臟受到損傷時其表達更加明顯。在人類多種腎臟損傷中如梗阻型腎病[8]、急性腎損傷[9]、膜性腎病[10]、抗基底膜腎病[11]、移植腎[12]、腎癌[13]等均可見HO-1表達于近端小管，腎損傷中HO-1的不同表達部位取決于HO-1所受到的刺激反應(yīng)，但仍主要表達于腎小管。一方面由于血紅蛋白在近端小管分泌導(dǎo)致近端小管產(chǎn)生HO-1，另一方面可能是由于腎臟近端小管較系膜細胞更易受到氧化應(yīng)激因素的影響，且更依賴HO-1的細胞保護作用[14]，還可能因為HO-1在防止腎小管上皮細胞損傷中發(fā)揮著重要的作用[15]。本研究中病例組有20例原發(fā)性腎小球疾病患者的腎組織HO-1表達陽性，且均在腎小管表達，腎小球及腎間質(zhì)未見HO-1表達，與上述研究相符。

HO-1作為體內(nèi)存在最廣泛且對細胞氧化損傷最敏感的抗氧化防御酶，在受到氧化應(yīng)激的刺激后可大量分泌，進而發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)、保護血管內(nèi)皮細胞等抗氧化作用。1997年，Durante等發(fā)現(xiàn)HO-1能抑制甚至逆轉(zhuǎn)腎小管的間質(zhì)纖維化，之后陸續(xù)的研究也證實了這種觀點。對腎小管內(nèi)HO-1進行誘導(dǎo)可以顯著減輕細胞氧化損傷，降低氧化應(yīng)激標志物表達水平[16]。一些誘導(dǎo)型橫紋肌溶解癥患者在組織受傷后會出現(xiàn)血紅素聚集于腎臟的現(xiàn)象，實驗證明，如果沒有HO-1的保護，這些物質(zhì)會對腎臟產(chǎn)生嚴重毒性[17]。HO-1降解血紅素的產(chǎn)物中的CO、Fe2+是誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)的兩種負性調(diào)節(jié)劑，可以通過降低iNOS的活性進而發(fā)揮對腎臟細胞的保護作用；腎小球腎炎患者腎小管產(chǎn)生HO-1后能抵抗腎小管損傷。HO-1的缺失可使腎小管轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)的表達、炎癥反應(yīng)和腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)增多，間接促進梗阻性腎病的纖維化。Shin等[18]研究發(fā)現(xiàn)，異硫氰酸鹽(抗氧化防御系統(tǒng)調(diào)控基因NRF2的激活劑)能阻止EMT基因轉(zhuǎn)變，而此改變與HO-1的調(diào)節(jié)密切關(guān)，提示HO-1可通過NRF2基因進來調(diào)節(jié)EMT，進而抑制腎間質(zhì)的纖維化。本研究結(jié)果顯示，不同腎小管間質(zhì)損害的原發(fā)性腎小球疾病患者腎組織的HO-1表達強度存在差異，表明腎間質(zhì)纖維化早期就有HO-1的表達，其可能起到阻止腎間質(zhì)纖維化的作用，C組患者腎組織HO-1表達強度低于B組，D組低于C組，分析其原因可能是由于HO-1的缺失促進了腎小管TGF-β的表達、炎癥反應(yīng)和EMT，進而加重了腎間質(zhì)纖維化。

Yokoyama等[19]測定了61例腎臟疾病患者及健康人尿沉渣HO-1的表達水平，并與尿β2微球蛋白(uβ2MG)和白介素6(IL-6)進行比較，以進一步研究腎小管損傷與HO-1的關(guān)系，患者的臨床診斷包括腎臟疾病綜合征、非腎小球血尿、IgA腎病、間質(zhì)性腎炎、急性腎小球腎炎、溶血性尿毒癥綜合征、川崎病。研究發(fā)現(xiàn)，uβ2MG在具有高細胞因子血癥的間質(zhì)性腎炎、溶血性尿毒癥綜合征中增高；雖然IL-6和 HO-1在炎性腎臟疾病患者尿液中均表達升高，但HO-1出現(xiàn)得更早，變化幅度也更大。因此，腎臟損傷患者尿液中HO-1較uβ2MG和IL-6出現(xiàn)得更早也更加敏感，尿HO-1可能是評估腎臟疾病小管間質(zhì)炎性損傷程度的一個實用的、新穎的、無創(chuàng)傷性的生物標記物。本研究結(jié)果顯示，不同腎小管間質(zhì)損害的原發(fā)性腎小球疾病患者尿HO-1表達水平存在差異，且C組尿HO-1表達水平高于B組，D組高于C組，與上述研究結(jié)果一致，表明尿沉渣HO-1表達水平可能作為早期評估腎間質(zhì)纖維化程度的一個重要指標，但其具體作用機制仍需進一步研究。

HO早在1964年就被發(fā)現(xiàn)并命名，但既往研究多集中于HO降解血紅素作用方面，直到2001年才有研究報道HO與腎臟疾病的關(guān)系，尿HO-1表達方面的研究極少。本研究觀察了不同腎小管間質(zhì)損害的原發(fā)性腎小球疾病患者腎組織及尿HO-1的表達，分析其與患者臨床特征之間的關(guān)系，具有一定創(chuàng)新性，但樣本量較小，且未與公認的反映腎間質(zhì)纖維化程度的指標進行對比，腎組織及尿HO-1表達的具體作用機制仍需進一步研究。

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