靳文英， 喬正國， 鄭春華 ，李素芳， 陳紅

阿霉素誘導的心力衰竭小鼠心臟去甲腎上腺素轉運蛋白的表達變化*

靳文英， 喬正國， 鄭春華 ，李素芳， 陳紅

目的： 觀察阿霉素誘導的充血性心力衰竭（心衰）小鼠心臟去甲腎上腺素轉運蛋白（NET）的表達變化。

去甲腎上腺素轉運蛋白；阿霉素；充血性心力衰竭；交感神經

(Chinese Circulation Journal, 2013,28:458.)

在心力衰竭（心衰）的發(fā)生發(fā)展中，交感神經系統(tǒng)的過度激活是加重心功能惡化的重要因素。去甲腎上腺素轉運蛋白（NET）位于腎上腺素能神經突觸前膜上，屬于單胺類 Na+/Cl-依賴性轉運蛋白，其功能是將神經元釋放的去甲腎上腺素（NE）再攝取回突觸前膜內，對調控突觸間隙中的NE濃度、終止神經沖動信號、維持受體對神經遞質的敏感性極 為 重 要[1,2]。 既 往 研 究 發(fā) 現 心 衰 時 存 在 有 心 臟NET 的表 達和功 能異常[3-6]， 其介導 的 NE 再攝取減少，可能在心衰的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。既往研究多采用主動脈結扎或心室快速起搏的方式來制備心衰動物模型，但手術操作可能損傷心臟附近的交感神經纖維，而手術打擊和心室快速起搏均會刺激交感神經系統(tǒng)的興奮，有可能會影響交感神經系統(tǒng)功能的測定。本研究利用阿霉素誘導的充血性心衰小鼠動物模型，在不影響交感興奮性的前提下觀察心衰早期 NET在心臟的表達變化。

1 材料與方法

慢性充血性心衰小鼠模型的建立：雄性C57BL/6J 小 鼠 共 20 只， 年 齡 3～4 周， 體 重（25.5±2.8）g。分 為對照組和 阿霉 素組各 10 只。參 照 Teraoka 的方 法[7]，阿霉 素組小鼠給予鹽酸阿霉素（輝瑞制藥有限公司 ）腹腔注射 2 mg/kg，每 3天注射一次共 5次，以后則每 7天注射一次共 6次，累計用量 22 mg/kg；對照組小鼠給予腹腔注射同等量的生理鹽水。兩組小鼠均正常飲食喂養(yǎng)，第10周末做為實驗終點。行超聲心動圖檢查檢測小鼠心功能。支配小鼠心臟的交感神經節(jié)主要發(fā)自頸中—星狀神經節(jié)復合體（middle cervical-stellate ganglion complex, MC-SGC），而 心 臟交 感 神經 NET mRNA在 MC-SGC 中表達，NET 則通過軸突運送至心臟的交感神經末梢突觸前膜上[8]。小鼠過量麻醉處死后，剪開胸腔暴露心臟及主動脈，于頸部中央分離雙側頸動脈旁的頸交感神經干，向下分離至主動脈弓，摘取頸交感神經節(jié)，并迅速摘取小鼠心臟，分別置于液氮中速凍，分離的頸交感神經節(jié)和心臟標本均凍存于 -70℃待測。分別稱量每只小鼠心臟和體重，計算心臟重量與體重之比（HW/BW）。

超聲心動圖：應用超聲心動圖儀（飛利浦公司 IE33）及 15 MHz 高頻探頭，小鼠半量麻醉，保持自主呼吸，于胸骨旁乳頭肌水平短軸切面采集左心室二維圖像，獲得二維引導下 10個心動周期的M型超聲心動圖記錄。測量左心室舒張末期內徑（LVDd），收縮末期內徑（LVDs）以及室間隔厚度（IVSd）和左心室后壁厚度（LVPWd），計算左心室舒張末期容積（LVEDV），LVEDV=7×LVDd3/ (2.4+LVDd)；左 心 室 收 縮 末 期 容 積（LVESV），LVESV=7×LVDs3/(2.4+LVDs)；并計算左心室射血分數（LVEF，%）=(EDV-ESV)/EDV，左心室短軸縮短率（FS，%）=（LVDd- LVDs）/LVDd；左心室質量 (LV mass) =1.05[(IVS+LVPWd+LVDd)3-LVDd3]。

實 時 熒 光 定 量 PCR 檢 測 mRNA 的 表 達：小 鼠NET mRNA 表達于支配心臟的頸交感神經節(jié)中，心臟的β1腎上腺素能受體則分布在心臟交感神經末梢內，取冰凍的頸交感神經節(jié)（MC-SG 復合體）和心 臟 組 織 勻 漿 后，Trizol法 提 取 組 織 總 RNA， 溶于 無 RNA 酶 水 中。 采 用 東 洋 坊 RT-PCR 試 劑 盒（TOYOBO，大阪，日本）逆轉錄，逆轉錄反應獲得 cDNA， 實 時 熒 光 定 量 PCR(PCR 分 析 儀：DNA Engine OpticonR，Bio-Rad； 分 析 軟 件：Opticon Monitor 3, Bio-Rad)測定 mRNA 含量。NET 引物序列為：上游 5’-GCACCTCCATTCTGTTTGCGGT-3’；下 游 5’-GCTCAACGAACTTCCAACACAGC -3’； 腎 上 腺 素 能 受 體 β1-AR 引 物 序 列：上游 5’-TGTGACGGCCAGCATCG-3’; 下 游5’-GCAGGCTCTGGTAGCGAAA-3’； 內 參 對照 采 用 磷 酸 甘 油 醛 脫 氫 酶 (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)， 引 物 序 列 為上 游 5’-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3’ ， 下游 5’-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3’。 反 應條 件 為：預 變 性 94℃ 3min， 變 性 94 ℃ 15 s， 退火 60 ℃ 15 s， 延 伸 72 ℃ 15 s， 共 40 個 循 環(huán)。以 GAPDH 作 為 內 參， 計 算 相 對 表 達 量 =2-△Ct，△ Ct=Ct（ 目 的 基 因 ）-Ct（ 內 參 基 因 ）。Ct值 為每個反應管內的熒光信號到達閾值時所經歷的循環(huán)數。

Western Blot法 測 定 心 肌 蛋 白 的 表 達：取 適量冰凍心肌組織，應用 RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟 PMSF）提取心肌組織總蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司 ）測定蛋白濃度[9]；加入十二烷基磺酸鈉（SDS）上樣緩沖液，100℃變性；進行 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；室溫封閉 2 h 后，將 PVDF 膜與一抗室溫下孵育 1h 并 4℃過夜，然后二抗室溫下孵育 1h；超敏化學發(fā)光法（ECL）顯影， 應 用 Bio-Rad 凝 膠 圖 像 成 像 系 統(tǒng) 和 Quality one 軟件進行掃描分析。兔抗鼠 NET 抗體購自Alomone 公司（Alomone Labs, 耶路撒冷，以色列 ），兔抗鼠 TH 抗體購自 Abcam 公司（劍橋市，馬薩諸塞州，美國）。

免疫組織化學染色：將小鼠心臟用 OCT包埋劑（SAKURA，洛杉磯，美國）包埋，于 -23℃切成 12 μm 厚的冰凍切片。取小鼠左心室冰凍切片，將 切 片 在 預 冷 的 10% 甲 醛 溶 液 中 固 定 10 min，PBS 磷酸鹽緩沖液（135 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8 mM K2HPO4, pH7.4）沖洗 3 次，滴加血清封閉液封閉 30 min 后，一抗 4℃過夜，常溫 復 溫 30 min，PBS 沖 洗 3 次；二 抗 37 ℃ 孵 育20 min，PBS 沖洗 3 次后滴加 SABC 溶液 20 min，PBS沖洗 3次，二氨基聯(lián)苯胺法（DAB）顯色，蒸餾水沖洗，脫水，透明，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察（Leica DM 4000B）。SABC（鏈霉親和素—生物素復合物）免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物公司，Masson 染色試劑盒購自上海江萊生物公司，并按照試劑盒說明書進行染色[10]。

統(tǒng)計學處理：數據以均數±標準差表示，使用SPSS 10.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。對兩組均數的比較采用兩樣本的t檢驗。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

兩組小鼠臨床及超聲結果：兩組小鼠分別腹腔注射阿霉素和生理鹽水，在實驗第 10周末，對照組小鼠生長良好，體重 (27.68±1.96) g，精神狀態(tài)好。阿霉素組小鼠 10周末死亡 2只，存活的 8 只小鼠體重（23.52±1.62） g，較對照組明顯減輕（P＜0.01），差異有統(tǒng)計學意義，且存在精神萎靡的表現，但兩組小鼠心臟/體重比值無明顯變化。行超聲心動圖檢查測定小鼠左心室收縮末及舒張末內徑，并計算心功能指標。阿霉素組小鼠經小劑量多次阿霉素腹腔注射后，與對照組比較心肌運動幅度明顯減弱（圖1），左心室射血分數、左心室短軸縮短率明顯降低，左心室收縮末期內徑、左心室舒張末容積、左心室質量明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05～0.01，表1），Masson 染色提示阿霉素組小鼠心肌纖維化較對照組增多（圖2）。

心衰小鼠心臟 NET的 mRNA 表達：實時熒光定量 PCR 的方法測定小鼠頸交感神經節(jié)中 NET 的 mRNA表達量無明顯變化。同時我們檢測了心臟腎上腺素能受體 β1-AR 的表達，結果顯示心衰小鼠心臟 β1-AR 的 mRNA 表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。

阿霉素組心衰小鼠心臟 NET的蛋白表達：采用Western blot方法檢測小鼠心臟中 NET 的蛋白表達量。如圖3所示，阿霉素組小鼠心臟組織NET的蛋白表達量明顯較對照組降低（P＜0.05），并且 NE 合成限速酶酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase, TH）的蛋白表達量顯著增加（圖3，P＜0.05）。進一步用免疫組化方法檢測TH染色陽性的交感神經纖維密度，如圖4所示，阿霉素組和對照組小鼠心臟交感神經纖維密度沒有明顯差異。

表1 小鼠超聲心動圖測量指標（±s）

圖1 實驗第 10 周末小鼠 M 型超聲心動圖

圖2 小鼠左心室 Masson 染色

圖3 小鼠心臟中 NET 和 TH 的蛋白表達

圖4 小鼠左心室交感神經纖維密度

3 討論

在心衰的發(fā)生發(fā)展中，交感神經系統(tǒng)的過度激活是加重心功能惡化的重要因素。目前一致認為，阻斷神經內分泌的過度激活，防治心肌重構是 治 療 心 衰 的 關鍵[11,12]。NET 位 于 交 感 神 經 突觸前膜上，對神經遞質的調控具有重要作用，但其在心衰中的作用尚不清楚。本文研究結果證實在阿霉素誘導的慢性充血性心衰小鼠模型中，在交感神經纖維密度無明顯變化的心衰早期，小鼠心臟 NET 的蛋白表達量下調，TH 蛋白表達增加，提示心衰早期時 NET 的表達下調可導致 NE 再攝取減少，心臟 NE蓄積致突觸前NE儲備耗竭，NE的合成代償性增加。

既往研究多采用主動脈結扎或心室快速起搏來制備心衰動物模型，但手術操作可能損傷心臟附近的交感神經纖維，而手術打擊和心室快速起搏均會刺激交感神經系統(tǒng)的興奮，有可能會影響交感神經系統(tǒng)功能的測定。阿霉素具有很強的心臟毒性，其累積的毒性可導致中毒性心肌炎、心肌病和心律失常，最終誘發(fā)充血性心衰，在不影響交感活性前提下是較好的研究容量超負荷心衰的動物模型。在我們的阿霉素誘導心衰小鼠模型中，心衰小鼠心臟NET mRNA 水平沒有變化，但蛋白表達量下降，表明心衰時 NET 存在轉錄后的下調。這與既往研究的報道一致：在主動脈縮窄術致充血性心衰的大鼠模型中，心臟 NET mRNA 表達不變，但心臟 NET再攝取功能受損，交感神經末梢 NET 蛋白表達和活性降低[13]。心衰 時 NET 存 在轉錄后蛋 白表達 的調控，這個調控可以是量的變化，也可以是細胞內靶向定位的改變。mRNA 代表基因轉錄水平，蛋白代表翻譯水平，表示功能。從 mRNA 到翻譯成蛋白的過程會受到不同水平的調控，而且蛋白磷酸化等一系列轉錄后修飾過程可導致蛋白水平的差異，例如蛋白的降解，另外一種情況則是翻譯后的蛋白不能有效運送至突觸前膜上。我們的研究結果表明，阿霉素誘導的充血性心衰小鼠心臟 NET蛋白表達下調，NE的合成限速酶TH蛋白表達顯著增加，表明心衰時 NET再攝取功能障礙導致 NE 在心臟的儲備耗竭，NE 代償性合成增加。但 NET mRNA和交感神經纖維密度沒有變化，β腎上腺素能受體未見明顯變化，提示在心衰早期即可出現 NET的再攝取功能障礙。

NET是位于中樞和外周腎上腺素能神經突觸前膜上的 Na+、Cl-依賴性轉運蛋白家族成員之一，與多巴胺轉運蛋白（DAT）、5 羥色胺轉運蛋白、γ氨基丁酸轉運蛋白等具有高度同源性。NET 由 617個氨基酸組成，分子量 60～85 kDa[2]。80%～90% 的去甲腎上腺素由 NET再攝取，對于調控突觸間隙和腎上腺素能受體周圍的 NE 濃度，終止 NE 作用，維持受體對神經遞質的敏感性起著至關重要的作用[1,2]。 交感 神 經系 統(tǒng) 活性 調 節(jié)紊 亂 是心 血 管疾病 的重要病理機制之一。交感神經支配的器官中，心臟NET的分布和 NE 再攝取的效率明顯高于其他如腎臟 和骨 骼肌等器官[1,2]。直 立性心動過 速綜合征患者 存 在 NET 基 因 缺 陷，NE 再 攝 取 功 能障礙[14,15]。在人體和動物研究中均已證實了 NET 表達和活性的 改變參與心衰的 發(fā)生發(fā)展[3-6]。心衰時心臟 NET介導的NE再攝取功能障礙，細胞外間隙長期慢性持續(xù)性NE的蓄積導致腎上腺素能受體的過度激活，并 誘 導心 肌肥厚 和心 室重構[16]。 而交 感 神經 的過度激活和腎上腺素能受體的表達下調正是β腎上腺素能受體阻滯劑治療心衰的病理基礎，但β受體阻滯劑發(fā)揮療效需要數月的時間，對 NET 表達和功能調控機制的進一步研究有助于促進心衰的診治進展。研究顯示 NET表達和活性的降低發(fā)生在心 衰 早期[5]， 動物實 驗 證實 增 加 NET 的表 達 或改善其功能可以改善心室重構和心功能：在心衰兔模型中利用轉基因技術于心肌中過表達 NET 可以增加 NE的再攝取，結果顯示左心室內徑縮小，射血分 數增 加， 同時心肌 β 受體的 下調 被逆轉[17]；而在心衰大鼠星狀神經節(jié)中注射神經生長因子可以增加 NE 的再攝取，改善左心室功能[18]。心臟移植前患者經左心室輔助裝置治療后心功能改善的同時伴隨 NET 蛋 白 表達 的 顯著 增 加[6]。小 劑 量卡 維 地洛在充血性心衰患者中使用1周，在不影響腎上腺素能受體的同時可以降低患者靜息和運動后的NE濃度，提示卡維地洛有可能可以改善 NET 的功能[19]。以上研究均證實 NET 的表達和活性調控很有可能是心衰治療的新靶點。

基于以上研究基礎，我們證實在不影響交感興奮性的前提下，阿霉素誘導的充血性心衰小鼠心臟NET的表達下調，心衰早期即可發(fā)生 NE 再攝取功能的障礙，NE代償性合成增加，交感神經系統(tǒng)過度激活形成惡性循環(huán)。NET的表達和調控在多種疾病包括精神、神經系統(tǒng)及心血管疾病中發(fā)揮著重要作用。對 NET表達和功能的調控機制的進一步探討有利于心衰的診治進展。

[1]Eisenhofer G. The role of neuronal and extraneuronal plasma membrane transporters in the inactivation of peripheral catecholamines. Pharmacol Ther, 2001, 91: 35-62.

[2]Schroeder C, Jordan J. Norepinephrine transporter function and human cardiovascular disease. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2012, 303: H1273-1282.

[3]Liang CS, Fan TH, Sullebarger JT, et al. Decreased adrenergic neuronal uptake activity in experimental right heart failure. A chamber-specific contributor to beta-adrenoceptor downregulation. J Clin Invest, 1989, 84: 1267-1275.

[4]B?hm M, La Rosée K, Schwinger RH, et al. Evidence for reduction of norepinephrine uptake sites in the failing human heart. J Am Coll Cardiol, 1995, 25: 146-153.

[5]Kawai H, Mohan A, Hagen J, et al. Alterations in cardiac adrenergic terminal function and beta-adrenoceptor density in pacing-induced heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2000, 278: H1708-1716.

[6]Haider N, Baliga RR, Chandrashekhar Y, et al. Adrenergic excess, hNET1 down-regulation, and compromised mIBG uptake in heart failure poverty in the presence of plenty. JACC Cardiovasc Imaging, 2010, 3: 71-75.

[7]Teraoka K, Hirano M, Yamaguchi K, et al. Progressive cardiac dysfunction in adriamycin-induced cardiomyopathy rats. Eur J Heart Fail, 2000, 2:373-378.

[8]Li H, Ma SK, Hu XP, et al. Norepinephrine transporter (NET) is expressed in cardiac sympathetic ganglia of adult rat. Cell Res, 2001, 11: 317-320.

[9]Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem， 1985， 150: 76-85.

[10]Goldner J. A modification of the masson trichrome technique for routine laboratory purposes. Am J Pathol，1938， 14: 237-243.

[11]張健 . β 受體阻滯劑在心力衰竭治療中的應用 . 中國循環(huán)雜志，2009， 24: 391-393.

[12]李為民 , 張曉偉 . 2012 年歐洲心臟病學會急慢性心力衰竭指南解讀 . 中國循環(huán)雜志，2012， 27: 33-38.

[13]Backs J, Haunstetter A, Gerber SH, et al. The neuronal norepinephrine transporter in experimental heart failure: evidence for a posttranscriptional downregulation. J Mol Cell Cardiol, 2001, 33: 461-472.

[14]Bayles R, Harikrishnan KN, Lambert E, et al. Epigenetic modification of the norepinephrine transporter gene in postural tachycardia syndrome. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2012, 32: 1910-1916.

[15]Lambert E, Eikelis N, Esler M, et al. Altered sympathetic nervous reactivity and norepinephrine transporter expression in patients with postural tachycardia syndrome. Circ Arrhythm Electrophysiol, 2008, 1: 103-109.

[16]Liang CS. Cardiac sympathetic nerve terminal function in congestive heart failure. Acta Pharmacol Sin, 2007, 28: 921-927.

[17]Münch G, Rosport K, Bltmann A, et al. Cardiac overexpression of the norepinephrine transporter uptake-1 results in marked improvement of heart failure. Circ Res, 2005, 97: 928-936.

[18]Kreusser MM, Haass M, Buss SJ, et al. Injection of nerve growth factor into stellate ganglia improves norepinephrine reuptake into failing hearts. Hypertension, 2006, 47: 209-215.

[19]Machida M, Takechi S, Fujimoto T, et al. Carvedilol improves uptake-1 in patients with systolic congestive heart failure. J Cardiovasc Pharmacol, 2012, 59: 175-181.

Protein Expression Changes of Norepinephrine Transporter in Adriamycin Induced Congestive Heart Failure Mice model

JIN Wen-ying, QIAO Zheng-guo, ZHENG Chun-hua, LI Su-fang, CHEN Hong.
Department of Cardiology, Peking University People’s Hospital, Beijing (100044), China

CHEN Hong, Email: chenhong0418@yahoo.com.cn

Objective: To observe the protein expression changes of norepinephrine transporter (NET) in adriamycin induced congestive heart failure (CHF) mice model.Methods: The adriamycin induced CHF mice model was established, the heart tissue and middle cervical-stellate ganglion complex (MC-SGC) were isolated. The mRNA expression of NET and adrenergic receptor (β1-AR) was detected by RT-PCR, the protein expression of NET and tyrosine hydroxylase (TH) was measured by Western blot analysis, and the cardiac sympathetic nerve fibers were examined with immunohistochemistry.Results: ① The mRNA expression of NET and β1-AR was unchanged in stellate ganglion in CHF mice. ② The protein expression was decreased in NET and increased in TH. ③ The density of sympathetic nerve fibers were unchanged in the early stage of CHF in mice model.Conclusion: The protein expression of NET was down-regulated and the unbalanced activity of sympathetic nerve may worsen the cardiac function in CHF mice model.

Norepinephrine transporter; Adriamycin; Congestive heart failure; Sympathetic nerve

2013- 06-03）

（編輯：汪碧蓉）

國家自然科學基金資助項目（No.31000472）

100044 北京市， 北京大學人民醫(yī)院 心臟中心

靳文英 主治醫(yī)師 博士 從事心血管疾病的基礎和臨床研究 Email：jjwyy@sina.com 通訊作者：陳紅 Email： chenhong0418@yahoo.com.cn

R54

A

1000-3614（2013）06-0458 -05

10.3969/j.issn.1000-3614.2013.06.015

方法： 建立阿霉素誘導的充血性心衰小鼠動物模型，分離小鼠心臟和頸交感神經節(jié)，實時熒光定量多聚酶鏈反應（PCR）的方法檢測 NET 和腎上腺素能受體 β1-AR 的 mRNA 表達，用 Western blot方法檢測 NET 和酪氨酸羥化酶（TH）的蛋白表達。免疫組化方法染色心臟交感神經纖維。

結果：①心衰小鼠心臟交感神經節(jié)中 NET 和 β1-AR 的 mRNA 表達無明顯變化。②心衰小鼠心肌組織中 NET 的蛋白表達顯著降低，而TH的蛋白表達上調。③心衰早期小鼠心肌交感神經纖維密度無明顯變化。

結論： 充血性心衰小鼠心臟 NET 的蛋白表達存在轉錄后的下調，心衰早期 NET 的表達下調可導致 NE 再攝取障礙，交感神經活性失衡從而加劇心功能的惡化。