龍建雄，蘇 莉，韋 波，陳 強(qiáng)，馮啟明，潘潤德，唐海寧，李柳姍，張海英，農(nóng)清清

精神分裂癥(Schizophrenia)是嚴(yán)重危害人類生命健康的精神疾病，終生患病率約為1%[1]。既往研究證明其遺傳度高達(dá)80%以上[2]，但其遺傳機(jī)制目前尚未完全明了。染色體22q11缺失攜帶者可能出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育、認(rèn)知、行為和精神等異常的風(fēng)險是普通人群的數(shù)倍，既往多個相互獨立的連鎖研究報道均提示在22號染色體長臂可能存在與精神分裂癥連鎖的易感位點[3]。脯氨酸脫氫酶(proline dehydrogenase,PRODH)基因位于染色體22q11缺失區(qū)，被認(rèn)為是精神分裂癥的位置候選基因。PRODH基因編碼的脯氨酸脫氫酶是一種線粒體酶，能促進(jìn)L-脯氨酸的新陳代謝， L-脯氨酸直接影響谷氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)傳遞，而谷氨酸系統(tǒng)缺陷假說一直是精神分裂癥的重要病因假說之一[4]，故PRODH基因也是備受關(guān)注的精神分裂癥功能候選基因。既往有關(guān)PRODH基因多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果并不一致[5-6]。為此，本研究對282例壯族、漢族精神分裂癥患者和282例壯族、漢族健康對照者，采用TaqMan MGB探針等位基因分型技術(shù)對PRODH-1945(T/C)多態(tài)性(即rs372055)進(jìn)行基因分析，探討該位點與廣西壯族、漢族精神分裂癥易感性的關(guān)聯(lián)性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組 包括壯族病例組和漢族病例組，納入與排除標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者經(jīng)至少兩名副主任醫(yī)師以上職稱的精神科?？漆t(yī)師根據(jù)國際疾病及相關(guān)健康問題分類第10版(ICD-10)精神與行為障礙分類臨床描述與診斷要點確診為精神分裂癥患者，并對實施診斷的醫(yī)師經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)，進(jìn)行診斷一致性檢驗，保證入組對象的同質(zhì)性；②患者自我(或其直系家屬)報告患者三代內(nèi)均為本民族血緣；③患者自我(或其直系家屬)報告患者籍貫為廣西人。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在各種腦器質(zhì)性疾病或軀體性疾病所致精神障礙，或由于藥物、治療所致的精神障礙；②合并腦卒中、癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病或其他嚴(yán)重的軀體性疾??；③精神發(fā)育遲滯者；④有嚴(yán)重腦創(chuàng)傷史者；⑤具有物質(zhì)濫用(包括藥物濫用和乙醇濫用)史者；⑥因嚴(yán)重興奮、沖動不配合者，或者有嚴(yán)重自殺、自傷傾向者。壯族病例組共納入94例患者，漢族病例組共納入188例患者，入選患者均為2010年4月—2010年6月廣西壯族自治區(qū)腦科醫(yī)院收治的精神分裂癥住院患者。

1.1.2 對照組 包括壯族對照組和漢族對照組，納入與排除標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：①健康正常人；②患者自我報告三代內(nèi)均為本民族血緣；③自我報告籍貫為廣西人。(2)排除標(biāo)準(zhǔn)： ①既往具有精神疾病病史或者精神疾病家族史者；②具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病病史或家族史者；③具有嚴(yán)重軀體疾病者；④具有嚴(yán)重家族性遺傳病史者；⑤有嚴(yán)重的頭部創(chuàng)傷史或產(chǎn)傷史者。共納入壯族對照94例，其中30例為2010年7月—2010年12月在廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢中心體檢的壯族健康體檢者，64例為2011年1月在廣西柳江縣(壯族聚居縣)招募的壯族健康志愿者。共納入漢族對照188例，均為2010年7月—2010年12月在廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院體檢中心體檢的漢族健康體檢者。由經(jīng)過統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查員，在納入對照前采用自編調(diào)查表與受試者進(jìn)行簡短會談，然后根據(jù)受試者自我報告情況，按照納入和排除標(biāo)準(zhǔn)納入合格對照。

上述564例受試者之間均無上代族間通婚史，也無親緣關(guān)系。所有患者或其家屬/法定監(jiān)護(hù)人及健康對照者在入組前詳細(xì)了解本研究的目的和程序，并取得其本人或患者家屬/法定監(jiān)護(hù)人的知情同意。

1.2 基因分型 采集每例受試者的外周靜脈血5 ml，置于含有EDTA抗凝劑的真空采血管內(nèi)，混勻， 4 ℃保存，并于3 d內(nèi)提取基因組DNA。采用天根科技(北京)有限公司生產(chǎn)的血液基因組DNA提取試劑盒〔TIANamp Blood DNA Kit(離心柱形),目錄號DP318DNA〕,血液基因組DNA的提取嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書操作。DNA提取后分裝為3管，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。采用TaqMan MGB探針等位基因分型技術(shù)對PRODH-1945(T/C)進(jìn)行基因分型。使用美國應(yīng)用生物系統(tǒng)(ABI) 公司生產(chǎn)的ABI7500 Fast 實時熒光定量PCR儀、TaqMan SNP基因分型試劑盒〔試劑盒內(nèi)含2×通用PCR預(yù)混試劑Universal PCR Master mix (無AmpErase UNG酶),40×SNP 基因分型試劑Genotyping Assay Mix〕。PCR反應(yīng)體系的總體積為10 μl，包含：2×TaqMan Universal PCR Mix 5.00 μl；Assay-on-Demand SNP Genotyping Assay Mix(40×) 0.25 μl；無核酸H2O 3.75 μl；基因組DNA 1.00 μl。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃10 min，變性92 ℃15 s、退火60 ℃1 min，變性及退火程序循環(huán)43次。采取以下措施進(jìn)行實驗操作質(zhì)量控制：對實驗操作者設(shè)盲，使操作者在進(jìn)行基因分型時不知道標(biāo)本的病例/對照狀態(tài)；每次96 孔PCR反應(yīng)板均設(shè)置2個空白對照和3個隨機(jī)重復(fù)樣本作為陽性對照；并隨機(jī)抽取總樣本中5% 的樣本進(jìn)行盲法重復(fù)測定,檢測結(jié)果一致率為100%。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的人口學(xué)特征 在壯族樣本中，病例組和對照組受試者的性別構(gòu)成、年齡間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在漢族樣本中，病例組和對照組受試者的性別構(gòu)成、年齡間差異亦均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在總樣本中，病例組和對照組受試者的性別構(gòu)成、年齡間差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表1、表2)。

2.2 Hardy-Weinberg平衡檢驗 擬和優(yōu)度χ2檢驗結(jié)果顯示，PRODH-1945(T/C)基因型在壯族、漢族對照組中的頻數(shù)分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，說明本研究所應(yīng)用的抽樣群體適合于遺傳分析(見表3)。

2.3PRODH-1945(T/C)與壯族、漢族精神分裂癥易感性的關(guān)聯(lián) 在壯族、漢族樣本中，病例組與對照組的PRODH-1945(T/C)基因型頻率、等位基因頻率的分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；由于壯族病例組與漢族病例組PRODH-1945(T/C)基因型頻率(χ2=0.316，P=0.854)、等位基因頻率(χ2=0.206,P=0.650)的分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義，壯族對照組與漢族對照組PRODH-1945(T/C)基因型頻率(χ2=0.872，P=0.648)、等位基因頻率(χ2=0.485,P=0.486)的分布差異也無統(tǒng)計學(xué)意義,故分別將兩個民族的病例組、對照組合并作為總樣本病例組、總樣本對照組，在總樣本中，病例組與對照組PRODH-1945(T/C)基因型頻率、等位基因頻率的分布差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表4、表5)。

表1 病例組與對照組受試者的性別構(gòu)成比較

Table1 Comparison of gender between schizophrenia patients and normal controls

組別例數(shù)性別〔n(%)〕男 女χ2值P值壯族病例組 94 60(63.8)34(36.2)1.4130.234對照組 94 52(55.3)42(44.7)漢族病例組188119(63.3)69(36.7)0.1020.749對照組188116(61.7)72(38.3)總樣本病例組282179(63.5)103(36.5)0.9060.341對照組282168(59.6)114(40.4)

表2 病例組與對照組受試者的年齡比較

Table2 Comparison of age between schizophrenia patients and normal controls

組組例數(shù)年齡(x±s,歲)t值P值壯族病例組 94 32.0±12.00.6130.542對照組 94 33.0±9.6漢族病例組18833.9±12.30.0740.941對照組18833.8±8.2總樣本病例組28233.2±12.20.3020.763對照組28233.5±8.7

表3 對照組樣本Hardy-Weinberg平衡的擬和優(yōu)度χ2檢驗

Table3 The χ2goodness-of-fit test of Hardy-Weinberg equilibrium in normal controls

分組實際頻數(shù)T/T T/C C/C預(yù)計頻數(shù)T/T T/C C/Cχ2值P值壯族對照 65 272 66 2620.1730.677漢族對照1255581245770.3810.537

表4 病例組與對照組受試者PRODH-1945(T/C)基因型頻率分布比較〔n(%)〕

Table4 Comparison ofPRODH-1945 (T/C) genotype frequency between schizophrenia patients and normal controls

組別例數(shù)基因型頻率〔n(%)〕T/T T/C C/Cχ2值P值壯族病例組94 62(65.95) 30(31.92) 2(2.13) 0.2290.892對照組94 65(69.15) 27(28.72) 2(2.13) 漢族病例組188120(63.83)62(32.98) 6(3.19) 0.8070.668對照組188125(66.48)55(29.26) 8(4.26) 總樣本病例組282182(64.64)92(32.62) 8(2.84) 0.9690.616對照組282190(67.38)82(29.08)10(3.54)

表5 病例組與對照組受試者PRODH-1945(T/C)等位基因頻率分布比較

Table5 Comparison ofPRODH-1945 (T/C) allele frequency between schizophrenia patients and normal controls

組別例數(shù)等位基因頻率〔n(%)〕T Cχ2值P值壯族病例組 94 154(81.91) 34(18.09) 0.1670.682對照組 94 157(83.51) 31(16.49) 漢族病例組188302(80.32) 74(19.68) 0.0770.781對照組188305(81.12) 71(18.88) 總樣本病例組282456(80.85)108(19.15)0.2110.646對照組282462(81.91)102(18.09)

3 討論

本研究在分子流行病學(xué)的水平上，進(jìn)行了PRODH-1945(T/C)基因多態(tài)性(即rs372055)與廣西壯族、漢族精神分裂癥易感性的關(guān)聯(lián)研究。為降低遺傳異質(zhì)性的影響，本研究選擇純民族血緣人群作為研究對象，納入祖籍廣西而且三代之內(nèi)都是壯族或三代之內(nèi)都是漢族血緣的樣本人群。PRODH-1945(T/C)基因型在壯族、漢族對照組中的頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，提示本研究樣本來自大的隨機(jī)婚配群體，沒有突變、選擇、遷移和遺傳漂變等進(jìn)化過程對遺傳平衡的影響，能夠代表各自群體的客觀情況，適合于遺傳分析。在基因分型實驗操作中，采用了工作效率和自動化程度均較高的Taqman基因分型實驗技術(shù)，并在實驗中采取了盲法等嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，保證基因分型的準(zhǔn)確性。

精神分裂癥的精神病理可能隨著文化和民族的不同而存在差異,這可能是種族和環(huán)境文化的差異所致。但目前我國有關(guān)少數(shù)民族人群精神分裂癥基因多態(tài)性的研究僅見對云南基諾族[7]、延邊朝鮮族的研究報道[8-9]，提示相關(guān)基因的變異可能與種族差異有一定關(guān)系。2007年廣西精神疾病流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，廣西≥15歲的城鄉(xiāng)居民精神分裂癥終生患病率為9.77‰，其中壯族人群患病率為10.93‰[10]。壯族是我國人口第二多的民族，而有關(guān)壯族人群精神分裂癥易感基因的分子遺傳學(xué)研究鮮見報道。

本研究結(jié)果顯示，無論是在壯族、漢族樣本中，還是在總樣本人群中，病例組與對照組的PRODH-1945(T/C)基因型頻率、等位基因頻率分布無明顯差異。既往有關(guān)PRODH-1945(T/C)基因多態(tài)性與精神分裂癥的關(guān)聯(lián)研究結(jié)果并不一致:Li等[11]在中國人群中的研究報道PRODH-1945(T/C)/PRODH-1852(G/A)PRODH*1945T-C/PRODH*1852G-A單倍體與精神分裂癥的陽性關(guān)聯(lián)。然而，多數(shù)研究未能發(fā)現(xiàn)PRODH基因多態(tài)性與精神分裂癥之間有關(guān)聯(lián)[9，12-14]。目前有2個Meta分析也顯示PRODH-1945(T/C)與精神分裂癥之間的關(guān)聯(lián)無統(tǒng)計學(xué)意義[15-16]。本研究也并未發(fā)現(xiàn)PRODH-1945(T/C)(即rs372055)與精神分裂癥易感性有關(guān)聯(lián),與既往多數(shù)研究結(jié)果相一致。

本研究雖然未發(fā)現(xiàn)PRODH-1945(T/C)基因多態(tài)性與壯族、漢族精神分裂癥易感性有關(guān)聯(lián)，但研究結(jié)果能為將來的Meta分析提供可利用的資料，為探明該遺傳變異在精神分裂癥發(fā)病機(jī)制中的真實作用提供參考數(shù)據(jù)。由于收集大數(shù)量的純民族精神分裂癥樣本相對困難，本研究的樣本量還不夠大，在今后的研究中，應(yīng)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步探討易患基因遺傳多態(tài)性在精神分裂癥易感性及其臨床表型發(fā)病機(jī)制中的作用機(jī)制。

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