楊士賢，吳鐵鏞，劉曉剛

緊密連接蛋白(claudins)是細胞間緊密連接的重要組成部分，其組成及結(jié)構(gòu)的完整性對細胞的穩(wěn)定有重要作用。緊密連接蛋白7(claudin-7)和緊密連接蛋白18(claudin-18)是claudins家族中具有代表性的成員，這兩者的異常表達在腫瘤進展過程中起重要作用[1]。claudin-7和claudin-18的表達可能與E鈣黏素(E-cadherin)有一定關(guān)系并共同促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在探討claudin-7、claudin-18和E-cadherin在胃腺癌組織中的表達及其意義，為腫瘤生物學(xué)研究提供參考。

1　材料與方法

1.1材料收集選擇我院2005年收治的胃腺癌患者81例，其中男49例，女32例；年齡45～78歲，平均59.9歲；胃腺癌診斷均符合世界衛(wèi)生組織(WHO)消化系統(tǒng)腫瘤病理學(xué)與遺傳學(xué)診斷標(biāo)準，術(shù)前均未進行放、化療；收集其手術(shù)切除后存檔的腺癌蠟塊組織為觀察組。選擇同期在我院進行胃鏡檢查正常者70例，其中男40例，女30例；年齡46～77歲，平均58.7歲；收集其胃體正常黏膜組織為對照組。

1.2檢測方法采用免疫組織化學(xué)法檢測claudin-7、claudin-18和E-cadherin水平，濃縮液均購自武漢博士德生物技術(shù)有限責(zé)任公司，均按比例稀釋后應(yīng)用。檢測步驟：(1)5 μm切片脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，3 min/次。(2)檸檬酸緩沖液高溫高壓抗原修復(fù)及乙二胺四乙酸(EDTA)抗原熱修復(fù)。(3)每張切片滴加1滴過氧化物阻斷溶液(試劑A)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，室溫下孵育10 min。(4)PBS沖洗3次，3 min/次。(5)甩去PBS，每張切片滴加1滴非免疫性動物血清(試劑B)，室溫下孵育10 min。(6)甩去血清，每張切片滴加1滴第一抗體，室溫下孵育60 min或4 ℃過夜。(7)PBS沖洗3次，3 min/次。(8)甩去PBS，每張切片滴加1滴生物素標(biāo)記的第二抗體(試劑C)，室溫下孵育10 min。(9)PBS沖洗3次，3 min/次。(10)甩去PBS，每張切片滴加1滴鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液(試劑D)，室溫下孵育10 min。PBS沖洗3次，3 min/次，甩去PBS，每張切片滴加2滴新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液。顯微鏡下觀察3～10 min，陽性顯色為棕色。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸分化，PBS沖洗返藍。切片經(jīng)梯度乙醇脫水干燥，中性樹膠封固。

1.3陽性結(jié)果判斷標(biāo)準claudin-7和claudin-18均定位于細胞質(zhì)，以細胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性；E-cadherin定位于細胞膜，以細胞膜出現(xiàn)連續(xù)的棕黃色顆粒為陽性。隨機選擇10個腫瘤細胞集中的高倍視野，計算陽性細胞占整個視野內(nèi)細胞總數(shù)的百分比，取平均值，以陽性細胞計數(shù)≥25%為陽性，<25%為陰性。

1.4觀察內(nèi)容(1)兩組claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率；(2)claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率與胃腺癌患者臨床特征的關(guān)系；(3)claudin-7、claudin-18和E-cadherin之間的相關(guān)性；(4)隨訪并計算觀察組患者5年生存率。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理，SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以百分數(shù)表示，采用χ2檢驗；claudin-7、claudin-18和E-cadherin之間的關(guān)系采用線性相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率比較兩組claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖1～6，見表1)。

表1兩組claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率比較〔n(%)〕

Table1Comparison of the positive rate of claudin-7，claudin-18 and E-cadherin between two groups

組別例數(shù)claudin-7claudin-18E-cadherin對照組7053(89.33)45(64.29)40(57.14)觀察組8121(25.93)27(33.33)18(22.22)χ2值55.944014.420819.3559P值<0.00010.0001<0.0001

注：claudin-7=緊密連接蛋白7，claudin-18=緊密連接蛋白18，E-cadherin=E鈣黏素

2.2claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率與胃腺癌患者臨床特征的關(guān)系claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率在不同腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及不同增殖細胞核抗原(PCNA)表達的胃腺癌患者中比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，在不同年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤臨床分期的胃腺癌患者中比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.3claudin-7、claudin-18和E-cadherin的相關(guān)性胃腺癌組織中claudin-7與claudin-18(r=0.43，P=0.0342)、claudin-18與E-cadherin(r=0.45，P=0.0461)、claudin-7與E-cadherin(r=0.40，P=0.0279)均呈正相關(guān)。

圖1claudin-7在胃腺癌組織中呈陰性表達(×400)圖2claudin-7在胃體正常黏膜組織中呈陽性表達(×400)

Figure1The negative expression of claudin-7 in gastric adenocarcinomaFigure2The positive expression of claudin-7 in normal gastric tissue

圖3claudin-18在胃腺癌組織呈陰性表達(×400)圖4claudin-18在胃體正常黏膜組織中呈陽性表達(×400)

Figure3The negative expression of claudin-18 in gastric adenocarcinomaFigure4The positive expression of claudin-18 in normal gastric tissue

圖5E-cadherin在胃腺癌組織中呈陰性表達(×400)圖6E-cadherin在胃體正常黏膜組織中呈陽性表達(×400)

Figure5The negative expression of E-cadherin in gastric adenocarcinomaFigure6The positive expression of E-cadherin in normal gastric tissue

表2claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達率與胃腺癌患者臨床特征的關(guān)系〔n(%)〕

Table2Relationship between the positive rate of claudin-7，claudin-18,E-cadherin and different clinical characteristic of gastric adenocarcinoma patients

例數(shù)claudin-7χ2值P值claudin-18χ2值P值E-cadherinχ2值P值年齡(歲)0.11570.73370.22500.63530.28930.5907 <553610(27.78)11(30.56)7(19.44) ≥554511(24.44)16(35.56)11(24.44)性別0.78080.37690.10330.74790.23620.6270 男4911(22.45)17(34.69)10(20.41) 女3210(31.25)10(31.25)8(25.00)腫瘤直徑(cm)1.44500.22930.39510.52960.00350.9526 <44113(31.71)15(36.59)9(21.95) ≥4408(20.00)12(30.00)9(22.50)腫瘤臨床分期2.90210.08850.22250.63710.50860.4757 Ⅰ+Ⅱ3914(35.90)14(35.90)10(25.64) Ⅲ+Ⅳ428(19.05)13(30.95)8(19.05)腫瘤分化程度6.74480.00944.93040.02644.15420.0415 高+中4617(36.96)20(43.48)14(30.43) 低354(11.43)7(20.00)4(11.43)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7.41740.00658.91490.00284.32160.0376 無4116(50.98)20(48.78)13(31.71) 有405(12.50)7(17.50)5(12.50)PCNA(%)6.07640.01379.91430.00165.66530.0173 <254316(37.21)21(48.84)14(32.56) ≥25385(13.16)6(15.79)4(10.53)

注：PCNA=增殖細胞核抗原

2.4觀察組患者5年生存率觀察組患者均獲得隨訪，隨訪時間8～60個月，平均33.1個月。觀察組患者5年生存率claudin-7陽性表達者(14/21，66.67%)與陰性表達者(3/60，5.00%)比較、claudin-18陽性表達者(16/27，59.26%)與陰性表達者(1/54，1.85%)比較、E-cadherin陽性表達者(14/18，77.78%)與陰性表達者(3/63，4.69%)比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為24.5880、14.7868和13.2048，P均<0.05)。

3　討論

胃腺癌是消化系統(tǒng)腫瘤中最常見的腫瘤之一，其發(fā)病機制較為復(fù)雜，細胞外基質(zhì)和黏附作用的改變在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[2-3]。生理情況下，上皮細胞以嚴密監(jiān)控細胞層的形態(tài)存在，在這樣的內(nèi)環(huán)境中，生長和活動被可溶性生長因子組成的網(wǎng)絡(luò)嚴密監(jiān)控并由細胞間緊密連接、細胞基質(zhì)及其間的空隙傳遞相關(guān)信息[4]，包括claudins的作用和鈣黏素(cadherin)的黏附作用。claudins是一組多基因家族蛋白質(zhì)，在大鼠和人類中至少有24位成員，分子量為22～27 kDa，含有4個跨膜結(jié)構(gòu)域、2個細胞外環(huán)形結(jié)構(gòu)及位于胞質(zhì)中的N末端及C末端結(jié)構(gòu)域[5-6]。相鄰細胞膜中的細胞外環(huán)可以相互作用，封閉細胞間隙，對細胞間形成離子通透的選擇性具有重要作用。claudin-7和claudin-18是claudins家族中的重要成員，可能是潛在的腫瘤抑制劑，尤其是對腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的抑制作用。E-cadherin是最重要的黏附物質(zhì)，也是cadherin家族的一個經(jīng)典成員[7-9]。目前研究認為，claudin-7、claudin-18和E-cadherin可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有內(nèi)在聯(lián)系[10-11]。

本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測胃腺癌患者癌組織中claudin-7、claudin-18和E-cadherin的表達，結(jié)果顯示，3者陽性表達率均低于胃體正常黏膜組織，且與患者腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及PCNA表達相關(guān)。表明claudin-7、claudin-18和E-cadherin在胃腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，且與腫瘤的分化、轉(zhuǎn)移及增殖有關(guān)，分析原因為：在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中，原發(fā)部位的腫瘤細胞脫落引起脈管轉(zhuǎn)移并累及淋巴結(jié)，細胞間黏附力減弱和細胞連接的松動是重要的始動因素。線性相關(guān)分析顯示，胃腺癌組織中claudin-7、claudin-18和E-cadherin之間均呈正相關(guān)，提示三者具有協(xié)同作用，可能通過內(nèi)在的位點共同調(diào)節(jié)細胞間連接的改變。有學(xué)者認為E-cadherin是腫瘤細胞浸潤轉(zhuǎn)移的抑制劑，即其表達水平升高，腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移能力下降，而在此過程中，claudins可能對E-cadherin有重要的調(diào)節(jié)作用，可引起細胞間結(jié)構(gòu)和功能的改變[12]。通過比較claudin-7、claudin-18和E-cadherin陽性表達者與陰性表達者5年生存率發(fā)現(xiàn)，claudin-7、claudin-18和E-cadherin的表達均與胃腺癌患者預(yù)后相關(guān)，聯(lián)合檢測claudin-7、claudin-18和E-cadherin的表達有助于判斷患者預(yù)后，即claudin-7、claudin-18和E-cadherin同時低表達的患者預(yù)后較差。

1李銳，張道榮，蔡存?zhèn)ィ?Claudin-7與Slug在肺鱗癌和腺癌中表達及其臨床意義[J].中國肺癌雜志，2011，14(6)：492-494.

2劉愛東，龐久玲，劉士生.胃癌中基質(zhì)金屬蛋白酶-9和CD105表達關(guān)系的研究[J].中國老年學(xué)雜志，2009，29(7)：886-887.

3許文集，莊瑛瑛，陳玉麗，等.Paxillin在胃腺癌和癌前期變化中的表達及意義[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2011，14(6)：2000.

4Szasz AM，Tokes AM，Micsinai M，et al.Prognostic significance of claudin expression changes in breast cancer with regional lymph node metastasis[J].Clin Exp Metastasis，2011，28(1)：55-63.

5曹云新，張松，楊安鋼.Claudin18在胰腺癌細胞中的表達[J].細胞與分子免疫學(xué)雜志，2009，25(12)：1202-1204.

6周雯，王青松.緊密連接蛋白claudin-10基因5′調(diào)控區(qū)序列的生物信息學(xué)分析[J].海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，16(7)：820-823.

7劉愛東，劉士生，許志萍，等.E-Cadherin在胃癌中的表達及意義[J].廣東醫(yī)學(xué)，2007，28(11)：1806-1807.

8Dong C，Wu Y，Yao J，et al.G9a interacts with Snail and is critical for Snail-mediated E-cadherin repression in human breast cancer[J].J Clin Invest，2012，122(4)：1469-1486.

9袁波，賀紅焰，王明勇,等.血管緊張素-(1-7)對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腎小管上皮細胞E-cadherin、α-SMA表達的影響[J].疑難病雜志，2011，10(5)：366.

10王若騰，胡潔，白亮.Clauudin-7與E-cadherin在肝癌中的表達及相關(guān)性[J].中國現(xiàn)代醫(yī)生，2011，49(16)：138-140.

11Ramos-Vara JA，Miller MA，Gilbreath E，et al.Immunohistochemical detection of CD34，E-cadherin，claudin-1，glucose transporter 1，laminin，and protein gene product 9.5 in 28 canine and 8 feline meningiomas[J].Vet Pathol，2010，47(4)：725-737.

12韓鳳艷，劉愛東.喉鱗癌中claudin-1、MMP-2和E-cadherin的表達及意義[J].中國誤診學(xué)雜志，2010，10(7)：1544-1545.