鳳 婷， 趙密珍， 王 鈺， 夏 瑾， 孟憲鳳

(1.安徽大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230601;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，江蘇 南京 210014)

草莓品種寧玉是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所選育，于2010年通過江蘇省品種委員會(huì)鑒定的新品種，該品種早熟，果實(shí)圓錐形、果型端正、色澤艷麗、風(fēng)味甜香，植株抗病性強(qiáng)、耐低溫性好，為優(yōu)良的設(shè)施栽培專用新品種［1］。針對(duì)這樣的優(yōu)良品種，如果能建立其再生體系，可以為今后進(jìn)一步利用與研究奠定基礎(chǔ)［2-3］。

由于草莓葉片、葉柄取材方便，便于攜帶和保存，早在20世紀(jì)80年代國外學(xué)者就開展了草莓葉片再生［4-5］的研究，中國很多研究者［6］也均通過試驗(yàn)建立了不同品種草莓葉片及葉柄再生體系［7-9］，均發(fā)現(xiàn)不同品種再生效率差距很大［10-11］。為此，本試驗(yàn)研究不同因素對(duì)寧玉再生的影響，旨在為寧玉再生體系的建立奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

寧玉為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所組培室培養(yǎng)的組培苗，選取轉(zhuǎn)接45 d左右的健壯植株，扯下由內(nèi)而外第3～7片幼嫩翠綠完全舒展開的葉齡在10～40 d左右的葉片，同時(shí)剪下所選葉片的葉柄，一起作為試驗(yàn)材料。

1.2 不定芽的誘導(dǎo)

1.2.1 激素組合的選擇 將基本培養(yǎng)基定為MS(蔗糖30.0 g/L，瓊脂6.2 g/L)+TDZ(2.0 mg/L)，在基本培養(yǎng)基上添加不同濃度的吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸(IAA)3種生長(zhǎng)素，以基本培養(yǎng)基為對(duì)照，共10個(gè)組合?；九囵B(yǎng)基與 IBA組合:IBA濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。基本培養(yǎng)基與NAA組合:NAA濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L?；九囵B(yǎng)基與IAA組合:IAA 濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。

將生長(zhǎng)狀態(tài)一致的葉片剪成邊長(zhǎng)約4 mm左右的正方形，接入培養(yǎng)基中，30 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.2 再生部位的比較 將生長(zhǎng)狀態(tài)一致的葉片剪成邊長(zhǎng)約4 mm左右的正方形，葉柄剪成長(zhǎng)約1 cm左右的條狀，中間用手術(shù)刀片切割3～4道傷口(不能切斷)，將葉柄和葉片一起放進(jìn)MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，外面一圈葉片，里面一圈葉柄，可以直觀的比較葉片和葉柄的誘導(dǎo)能力。每隔10 d觀察試驗(yàn)結(jié)果，30 d后統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.2.3 暗培養(yǎng)時(shí)間的篩選 將接種后的葉片和葉柄放進(jìn)組培室黑箱中進(jìn)行5 d、10 d、15 d、20 d的暗培養(yǎng)，直接光培養(yǎng)的作為空白對(duì)照。暗培養(yǎng)結(jié)束后放到正常光下培養(yǎng)，接種后30 d統(tǒng)計(jì)不同暗培養(yǎng)時(shí)間處理的誘導(dǎo)結(jié)果。

1.2.4 葉齡的篩選 分別選取葉齡為10 d、20 d、30 d、40 d左右的葉片做為材料，同上剪切后正面朝上放進(jìn)同一瓶MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種30 d后比較不同葉齡葉片的誘導(dǎo)結(jié)果。

1.2.5 放置方式的比較 選取最佳誘導(dǎo)葉齡的葉片剪切后以不同方式(一半葉片剪切后正面向上接到外一圈，另一半剪切后反面向上接到內(nèi)一圈)放進(jìn)同一瓶培養(yǎng)基，接種30 d后觀察葉片不同放置方式對(duì)芽誘導(dǎo)的影響。

1.2.6 培養(yǎng)條件與統(tǒng)計(jì)方法 本試驗(yàn)各處理均接種10瓶，每瓶10個(gè)葉片(柄)，重復(fù)3次，放到組培室［光照度3 000 lx，光照14 h/d，溫度(25±2)℃］進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。30 d后統(tǒng)計(jì)不定芽的誘導(dǎo)率。

葉片不定芽誘導(dǎo)率=長(zhǎng)出不定芽的葉片總數(shù)/接種的葉片總數(shù)×100%;

葉柄不定芽誘導(dǎo)率=長(zhǎng)出不定芽的葉柄總數(shù)/接種的葉柄總數(shù)×100%。

1.3 生根及移栽

將上述試驗(yàn)中的再生芽做生根培養(yǎng)的試驗(yàn)材料。

第一步:基本培養(yǎng)基的選取。配MS、1/2MS、1/4MS培養(yǎng)基。將再生芽剪下接種，進(jìn)行生根培養(yǎng)，25 d后統(tǒng)計(jì)生根率、平均每株生根條數(shù)及根須長(zhǎng)度，選出生根最佳基本培養(yǎng)基。

第二步:將第一步篩選出的培養(yǎng)基定為基本培養(yǎng)基，進(jìn)行添加激素試驗(yàn)，探索最佳生根培養(yǎng)基的最佳激素組合。選取IBA、NAA以及IAA 3種生長(zhǎng)素分別與基本培養(yǎng)基進(jìn)行不同量組合，以基本培養(yǎng)基為對(duì)照，共10個(gè)組合?；九囵B(yǎng)基與IBA組合:IBA濃度分別為 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L?；九囵B(yǎng)基與 NAA組合:NAA濃度分別為0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L?；九囵B(yǎng)基與IAA組合:IAA濃度分別為 0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L。

將各組合調(diào)pH到5.8，放到組培室［光照度3 000 lx，光照14 h/d，溫度(25±2)℃］進(jìn)行恒溫培養(yǎng)。每個(gè)處理接種5瓶，每瓶接種10株再生芽，重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計(jì)生根情況。

再生苗根部生長(zhǎng)至4 cm左右時(shí)開啟封口膜，往瓶?jī)?nèi)注入2 ml自來水后于室溫下煉苗1 d。然后用鑷子夾出于自來水龍頭下洗凈粘附的培養(yǎng)基，去掉外面一層老葉整理干凈后栽到36格的營養(yǎng)缽中，將水澆透基質(zhì)，放進(jìn)大棚，以后1 d澆1次水保持基質(zhì)充分濕潤(rùn)，14 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果

2.1 不同激素組合的誘導(dǎo)效果

從不同激素組合誘導(dǎo)的結(jié)果顯示:在IBA、NAA、IAA 3種激素中，NAA的誘導(dǎo)效果最好，另外2種激素的誘導(dǎo)效果無明顯差異;對(duì)于同一種激素來說，激素添加量過少，誘導(dǎo)效率較低，但是添加量過高，誘導(dǎo)率增加不明顯，玻璃化苗的機(jī)率大大增加。綜合各結(jié)果:添加0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基誘導(dǎo)效果最好。

2.2 再生部位

從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，葉柄出芽時(shí)間早于葉片，其誘導(dǎo)率高于葉片，說明葉柄再生能力強(qiáng)于葉片。從傷口的愈傷情況可以看出葉片和葉柄的基部誘導(dǎo)能力均高于葉頂部，誘導(dǎo)能力從強(qiáng)到弱依次為葉柄基部＞葉片基部＞葉片頂部＞葉柄頂部。

2.3 暗培養(yǎng)時(shí)間

從幾種不同暗培養(yǎng)時(shí)間的外植體生長(zhǎng)情況來看，10 d是最佳的暗培養(yǎng)時(shí)間，外植體誘導(dǎo)率達(dá)到50%。0 d、5 d的暗培養(yǎng)時(shí)間過短，葉片幾乎不分化而且直接褐化枯萎，誘導(dǎo)率為零;15 d、20 d暗培養(yǎng)時(shí)間太長(zhǎng)，誘導(dǎo)率不高，分別為24%和17%。

2.4 葉齡

從試驗(yàn)過程和結(jié)果來看，葉齡太小，不僅操作麻煩，難以修剪，而且分化率低，10 d大小的葉片葉面積太小，剪切不利，沒有分化。30 d葉齡葉片誘導(dǎo)率只有12%，40 d葉齡葉片誘導(dǎo)率不高，在10%以下。20 d葉齡的葉片分化效果最佳，為46%。由此可見，葉齡過小、過大都不利于誘導(dǎo)，20 d葉齡大小合適，誘導(dǎo)活力最強(qiáng)，這可能與20 d時(shí)葉片中的激素水平適中有關(guān)。

2.5 放置方式

通過比較葉片的2種放置方式得出，正面朝上的放置方式誘導(dǎo)率達(dá)到52%，反面朝上放置方式的誘導(dǎo)率只有31%，這與很多文獻(xiàn)所得出的結(jié)果基本一致。很多學(xué)者認(rèn)為原因是葉片下表面氣孔較多，與培養(yǎng)基接觸容易從培養(yǎng)基中吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì)，所以正面朝上比較容易誘導(dǎo)再生。

2.6 生根培養(yǎng)基

試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn):1/4MS培養(yǎng)基中再生芽最早生根，14 d時(shí)根須多而且長(zhǎng)，平均每株生4～8條根須;MS培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的根系較粗壯，但是伸長(zhǎng)速度較慢;1/2MS培養(yǎng)基中再生芽的生根速度及根須數(shù)皆不如1/4MS培養(yǎng)基。1/4MS培養(yǎng)基中組培苗株高不如MS培養(yǎng)基，但是移栽后發(fā)現(xiàn)1/4MS培養(yǎng)基的組培苗長(zhǎng)勢(shì)和MS培養(yǎng)基無顯著差異，估計(jì)是生根后期營養(yǎng)的缺失導(dǎo)致。綜合各因素，選取1/4MS培養(yǎng)基為最佳生根基本培養(yǎng)基。

在上述選取的最佳基本培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，進(jìn)行添加激素試驗(yàn)，25 d后統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果得出:生根率均可達(dá)到100%;但是IAA添加濃度為0.2 mg/L時(shí)生根較早，同時(shí)，在添加IAA培養(yǎng)基中，植株的根長(zhǎng)、株高均優(yōu)于添加IBA培養(yǎng)基;添加NAA的培養(yǎng)基，生根數(shù)量較多，植株高，但是極易長(zhǎng)出白色瘤狀物質(zhì)，綜合以上結(jié)果得出:生根培養(yǎng)基成分可確定為:1/4MS+IAA(0.2 mg/L)。

2.7 移栽后成活率

移栽14 d后觀察發(fā)現(xiàn)大部分再生苗植株長(zhǎng)高，葉片長(zhǎng)大、增多，情況良好，成活率達(dá)到97.22%。添加IAA組合再生苗移栽后長(zhǎng)勢(shì)最好，添加NAA組合死苗很多，添加IBA組合草莓苗瘦弱矮小，長(zhǎng)勢(shì)不佳。

3 討論

綜合本試驗(yàn)結(jié)果可得出:草莓品種寧玉不定芽再生最佳培養(yǎng)基是 MS(蔗糖 30 g/L，瓊脂 6.2 g/L)+TDZ(2.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L);葉片及葉柄基部誘導(dǎo)能力最強(qiáng);10 d左右是暗培養(yǎng)最佳時(shí)間;20 d葉齡的葉片是最佳誘導(dǎo)材料;葉片正面朝上比反面朝上放置方式好;最佳生根培養(yǎng)基為1/4MS+IAA(0.2 mg/L);生根率可達(dá)到100%;煉苗移栽后成活率可達(dá)到97.22%。

本試驗(yàn)利用TDZ激素誘導(dǎo)再生，雖然再生率不低，但是有文獻(xiàn)曾報(bào)道:TDZ的過度使用會(huì)增加產(chǎn)生玻璃化苗的風(fēng)險(xiǎn)，該試驗(yàn)過程中確實(shí)有小部分玻璃化苗出現(xiàn)，所以后續(xù)工作剔除玻璃化苗是關(guān)鍵步驟。

將葉片和葉柄一同培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)葉柄誘導(dǎo)芽的能力比葉片強(qiáng)，這與很多參考文獻(xiàn)中提到的葉片誘導(dǎo)能力較強(qiáng)，葉柄比葉片容易誘導(dǎo)出愈傷組織，但不易直接誘導(dǎo)出芽［12］的結(jié)果不一致，這可能是基因型不同造成的，具體原因還需進(jìn)一步探討。本試驗(yàn)結(jié)果也表明葉柄和葉片基部誘導(dǎo)能力均強(qiáng)于頂部。

有很多研究結(jié)果表明，在IBA，NAA，IAA 3種生長(zhǎng)素中，IBA誘導(dǎo)再生能力比NAA強(qiáng)［13］，而在本試驗(yàn)結(jié)果中，誘導(dǎo)能力最強(qiáng)的是NAA，IAA較弱，最差的是IBA，其具體原因有待進(jìn)一步研究。

一些研究結(jié)果表明:再生過程中，暗培養(yǎng)后放到光下培養(yǎng)，如果外植體褐化無綠色而且無膨大現(xiàn)象，基本可以肯定是誘導(dǎo)失敗。但本試驗(yàn)品種寧玉在誘導(dǎo)過程中，出現(xiàn)上述現(xiàn)象后，仍然具有很強(qiáng)的再生活力。由此可以證明該品種確實(shí)是抗性很強(qiáng)的優(yōu)良品種，具體原因需以后從分子學(xué)層面深入探討。

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