季英華， 周曉偉， 張 暉， 周益軍

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，江蘇 南京 210014)

番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)是番茄上一種毀滅性的病毒，分類(lèi)上屬于雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)，主要傳播介體為煙粉虱(Bemisia tobaci)。該病毒早在1964年以色列就有發(fā)生危害報(bào)道［1］，近年來(lái)，隨著全球氣候變暖和耕作制度的改變以及國(guó)際間貿(mào)易的增加，TYLCV在全球范圍傳播，給番茄等作物的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害［2-3］。2006年TYLCV在上海和浙江等地陸續(xù)出現(xiàn)危害，隨后幾年迅速擴(kuò)展至江蘇、安徽、山東、河南、河北、北京等地［4-8］。據(jù)各地植保部門(mén)的不完全統(tǒng)計(jì)，2009年中國(guó)番茄黃化曲葉病的年發(fā)生面積超過(guò)2.0×105hm2，遭受?chē)?yán)重?fù)p失的面積在6.6×104hm2以上，經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)5.0×109元。

在TYLCV檢測(cè)上，比較常用的方法是基于PCR的分子檢測(cè)［9-10］，該方法具有靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較短等優(yōu)勢(shì)，但存在設(shè)備要求高、操作繁瑣、成本較高等問(wèn)題，很難應(yīng)用于基層和大批量樣品的檢測(cè)，而病害的調(diào)查和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)往往需要檢測(cè)大量樣本，因此建立一種快捷、簡(jiǎn)便、高效而又成本較低的檢測(cè)方法是一項(xiàng)迫在眉睫的任務(wù)。本研究擬建立一種基于DIBA(斑點(diǎn)免疫結(jié)合分析法)的TYLCV快速檢測(cè)方法，旨在為病害的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)及病害調(diào)查提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試番茄病樣為室內(nèi)接種獲得的TYLCV病株，健康番茄材料為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培育的不含TYLCV番茄苗，田間樣品于2011年采自江蘇南京。

1.2 抗體和試劑

TYLCV單克隆抗體［11］由浙江大學(xué)周雪平老師提供;堿性磷酸酯酶(AP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG購(gòu)自SIGMA;硝酸纖維素膜購(gòu)自PALL;dNTP、Taq酶購(gòu)自TaKaRa;顯色底物BCIP/NBT購(gòu)自上海生工生物工程有限公司;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 DIBA 檢測(cè)方法［12］

(1)在硝酸纖維素膜上劃0.5 cm×0.5 cm方格，根據(jù)試驗(yàn)樣品數(shù)裁剪，1個(gè)樣品用1個(gè)方格。(2)取植物樣品0.1 g，加1 ml碳酸鹽包被液，充分研磨;(3)低速離心3～5 min，取上清3～5 μl點(diǎn)膜，室溫晾干;(4)用含3%脫脂奶粉的PBST緩沖液37℃封閉45 min;(5)將膜浸入含有單抗的PBST緩沖液(含3%脫脂奶粉)中37℃孵育1.5 h;(6)PBST洗膜3～4次，每次5 min;(7)加入AP標(biāo)記羊抗鼠IgG(含3%脫脂奶粉的PBST緩沖液1∶6 000稀釋)，37℃孵育1.5 h;(8)PBST洗膜3～4次，每次5 min;(9)將膜浸入顯色底物BCIP/NBT中充分顯色;(10)加雙蒸水終止反應(yīng)，觀(guān)察記錄結(jié)果。

1.4 單抗作用濃度的優(yōu)化

單抗按1∶3 000、1∶5 000、1∶8 000、1∶15 000、1∶20 000、1∶40 000、1∶80 000及1∶160 000稀釋構(gòu)建濃度梯度，DIBA檢測(cè)后，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選擇最佳單抗?jié)舛取?/p>

1.5 靈敏度檢測(cè)

將植物樣品研磨勻漿后得到的原液［鮮重(g)∶包被液(ml)=0.1∶1.0］按1∶50、1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶ 3 200、1∶6 400、1∶ 12 800、1∶ 25 600 及1∶51 200稀釋構(gòu)建濃度梯度，方法參照方法1.3，單抗?jié)舛葏⒄辗椒?.4，測(cè)定建立的DIBA方法檢測(cè)樣品的靈敏度，設(shè)3次重復(fù)。

1.6 準(zhǔn)確性檢測(cè)

對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存的確認(rèn)感染TYLCV的番茄樣品和健康番茄樣品共抽選10份，分別用PCR方法［6］和DIBA檢測(cè)，單抗?jié)舛葏⒄辗椒?.4，每個(gè)樣品重復(fù)2次。根據(jù)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果來(lái)評(píng)估建立的DIBA檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性。

1.7 穩(wěn)定性檢測(cè)

利用已建立的DIBA檢測(cè)方法，對(duì)同一批番茄樣品(同時(shí)含有陽(yáng)性和陰性)進(jìn)行3次重復(fù)檢測(cè)試驗(yàn)，每次重復(fù)中，每個(gè)樣品研磨后在膜上重復(fù)點(diǎn)膜3次，根據(jù)3×3次重復(fù)的結(jié)果來(lái)判定檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。

1.8 田間樣品檢測(cè)

大田隨機(jī)采樣，利用建立的DIBA方法對(duì)采集樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果來(lái)檢驗(yàn)建立的DIBA方法對(duì)田間樣品的檢測(cè)能力。

2 結(jié)果

2.1 最適單抗?jié)舛葍?yōu)化

在其他條件不變的前提下，對(duì)單抗進(jìn)行稀釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)當(dāng)單抗稀釋度在1∶3 000～1∶20 000時(shí)，利用DIBA方法可以很明顯地區(qū)分樣品，只是稀釋度在1∶3 000時(shí)，陰性樣品有少許顯色。當(dāng)單抗稀釋到1∶40 000及以上時(shí)，陽(yáng)性樣品雖然也有顯色，但是顯色不明顯。因此理論上單抗的稀釋范圍可以為1∶3 000～1∶20 000，推薦使用 1∶5 000～1∶15 000，本研究后續(xù)試驗(yàn)單抗稀釋度采用1∶8 000。

2.2 靈敏度檢測(cè)

將植物樣品處理后的原液(鮮重(g)∶包被液(ml)=0.1∶1.0)進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢?duì)稀釋樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示:在3次重復(fù)中，原液稀釋到1∶800時(shí)，陽(yáng)性樣品還可以看到非常淡的顯色，稀釋到1∶1 600時(shí)基本上看不見(jiàn)顯色，所以推測(cè)單抗檢測(cè)植物樣品的極限是1∶800，在檢測(cè)樣品時(shí)推薦采用原液或者原液稀釋50倍。

2.3 準(zhǔn)確性檢測(cè)

對(duì)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存的感染TYLCV的番茄樣品和健康番茄樣品進(jìn)行抽樣檢測(cè)，PCR檢測(cè)結(jié)果顯示10份樣品中有6份樣品為陽(yáng)性;利用DIBA也檢測(cè)到了6份，并且與PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致，說(shuō)明建立的DIBA方法可以較準(zhǔn)確地檢測(cè)TYLCV。

2.4 穩(wěn)定性檢測(cè)

從實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存的感染TYLCV的番茄樣品和健康番茄樣品中抽選8份進(jìn)行DIBA檢測(cè)，結(jié)果同一樣品3次重復(fù)檢測(cè)試驗(yàn)顯色一致，同一樣品研磨后3次重復(fù)點(diǎn)膜顯色也一致，說(shuō)明建立的DIBA方法檢測(cè)TYLCV具有較好的穩(wěn)定性。

2.5 田間樣品檢測(cè)

對(duì)2011年采自江蘇南京日光溫室的30份番茄樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果也表明建立的DIBA檢測(cè)方法可以對(duì)田間樣品進(jìn)行有效檢測(cè)。

3 討論

對(duì)于TYLCV的檢測(cè)方法，前人有很多報(bào)道，包括血清學(xué)、PCR 檢測(cè)、核酸雜交檢測(cè)等［9，13-16］，但是 DIBA 檢測(cè)方法對(duì)于檢測(cè)大批量樣品有其無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)。

在利用DIBA檢測(cè)樣品時(shí)，若直接采用原液(不稀釋)，有時(shí)會(huì)有色素或雜質(zhì)影響，建議在對(duì)粗樣低速離心時(shí)適當(dāng)延長(zhǎng)離心時(shí)間或者選擇相對(duì)較高的離心速度，這樣可以較好地減少色素或雜質(zhì)的影響。雖然本試驗(yàn)結(jié)果表明單抗稀釋度在1∶3 000～1∶20 000時(shí)也能顯色，但是在檢測(cè)大量樣品時(shí)推薦使用1∶5 000或者 1∶8 000稀釋度，這樣能較好地兼顧穩(wěn)定性和靈敏度。很多研究結(jié)果顯示大多數(shù)雙生病毒的增殖部位局限于植物韌皮部組織［17-19］，我們?cè)诶脝慰箤?duì)番茄不同部位的TYLCV進(jìn)行Western-blot分析時(shí)也發(fā)現(xiàn):韌皮部病毒的含量最高，推測(cè)檢測(cè)時(shí)取樣的最佳部位應(yīng)該是韌皮部，但是韌皮部在檢測(cè)時(shí)候會(huì)存在一些問(wèn)題，比如采樣不方便、樣品處理較費(fèi)時(shí)，因此本方法還是采用番茄葉片作為取樣部位進(jìn)行檢測(cè)，該方法也同樣適用于韌皮部組織的樣品檢測(cè)，而且可能會(huì)有更高的靈敏度。在檢測(cè)大量樣品時(shí)，比較DIBA與PCR的檢測(cè)結(jié)果，有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)它們存在一些差異，這可能與二者的檢測(cè)靈敏度、特異性等因素相關(guān)，但從目前我們對(duì)江蘇及周邊地區(qū)的樣品檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，二者還是基本一致的。

在菜豆金色花葉病毒屬中，與TYLCV序列接近的病毒有多種，利用單抗進(jìn)行檢測(cè)時(shí)也可能會(huì)檢測(cè)到一些近緣的病毒，因此，田間調(diào)查時(shí)建議采用兩步法:第一步，先DIBA檢測(cè);第二步，抽選DIBA檢測(cè)結(jié)果中的陽(yáng)性樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)。這樣既提高了樣品的檢測(cè)量，又保障了樣品檢測(cè)的準(zhǔn)確性。對(duì)于目前只有TYLCV發(fā)生地區(qū)，如江蘇、安徽、山東等地，只用DIBA檢測(cè)方法來(lái)檢測(cè)TYLCV是可行的，同時(shí)也建議抽樣進(jìn)行PCR檢測(cè)，以防有新病毒傳入。

致謝: 本研究所用TYLCV單克隆抗體由浙江大學(xué)周雪平老師提供，在此表示衷心感謝!

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