張妤 楊霞 殷正豐

?綜 述?

循環(huán)肝癌細胞的研究進展和技術(shù)問題

張妤 楊霞 殷正豐★

復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致絕大多數(shù)肝癌患者術(shù)后死亡的主要原因?，F(xiàn)有的研究提示，從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放進入血液的循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是肝癌根治性術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個主要根源。在過去的10多年中，盡管CTCs檢測技術(shù)及其臨床意義的研究取得了長足進步，但由于缺乏可使用的肝癌CTCs檢測方法，目前人們對于肝癌CTCs臨床重要性的認識遠不及其他主要類型的腫瘤?？上驳氖?，近年來關(guān)于肝癌CTCs檢測方法及其臨床意義的研究報道逐漸增多，并且得到一些有趣的結(jié)果。本文著重總結(jié)已報道的肝癌CTCs檢測方法，綜述肝癌CTCs作為肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移來源的現(xiàn)有實驗證據(jù)以及其作為肝癌預(yù)后標志物的現(xiàn)有研究結(jié)果，并討論肝癌CTCs臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用需要解決的技術(shù)問題。

肝細胞癌；循環(huán)腫瘤細胞；復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移；預(yù)后

循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cells，CTCs）是從原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶釋放進入血液循環(huán)系統(tǒng)中的腫瘤細胞。已知轉(zhuǎn)移是大多數(shù)腫瘤患者死亡的直接原因，而CTCs則可能是形成轉(zhuǎn)移的種子，標志著腫瘤細胞的播散[1]。作為原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶之間的鏈接，腫瘤生物學(xué)和轉(zhuǎn)移的窗口，以及可以多次、實時、非侵入性獲取、以及具有腫瘤代表性的“液體活檢”（liquid biopsy）樣本，CTCs不僅將成為指導(dǎo)個體化腫瘤診療的一個不可替代的生物標志物，而且是研究腫瘤轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)過程和機制的一個重要切入點[2～4]。近年來，隨著多種分離、鑒定稀少CTCs實驗技術(shù)的建立，使大范圍的CTCs基礎(chǔ)和臨床研究成為可能，并已成為腫瘤研究臨床轉(zhuǎn)化最活躍的領(lǐng)域之一，目前國際上至少已經(jīng)有400多個涉及CTCs的臨床研究正在進行[2～4]。然而，我國在CTCs研究領(lǐng)域起步較晚，加之投入不足，現(xiàn)已遠遠落后于歐美國家。其中無論在國內(nèi)外，由于重視不夠，以及缺乏可使用的肝癌CTCs檢測方法，肝癌CTCs研究的落后地位尤為突出，人們對于肝癌CTCs臨床重要性的認識遠不及其他主要類型的腫瘤。好在近年來關(guān)于肝癌CTCs檢測方法及其臨床意義的研究報道逐漸增多，落后局面有望改觀。關(guān)于CTCs檢測方法和臨床應(yīng)用的研究進展可參見我們在其他刊物上發(fā)表的文章[4～6]。本文著重綜述已報道的肝癌CTCs檢測方法，肝癌CTCs作為肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移來源的現(xiàn)有實驗證據(jù)以及肝癌CTCs作為肝癌預(yù)后標志物的現(xiàn)有研究結(jié)果，并討論肝癌CTCs臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用需要解決的技術(shù)問題。

1 已報道的肝癌CTCs檢測方法

在現(xiàn)有的CTCs檢測方法中，僅有RT-PCR、微過濾器法、流式細胞術(shù)和磁性細胞分選法等方法被報道應(yīng)用于肝癌CTCs檢測，并且都是在梯度密度離心富集單個核細胞后進行檢測。

1.1 RT-PCR和qRT-PCR

通過基因擴增方法分析外周血單個核細胞中肝細胞特異性基因或腫瘤細胞相關(guān)基因的表達，間接反映肝源性細胞的存在，包括肝癌細胞CTCs。在過去20年中，有研究將甲胎蛋白（AFP）[7]、白蛋白[7]、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（TERT）[8]和轉(zhuǎn)錄因子Snail等[9]基因作為標志物應(yīng)用于外周血肝癌細胞CTCs的檢測。其中只有AFP是一個公認的肝癌標志物[10]。此類方法靈敏度非常高，缺點是CTCs被破壞而無法計數(shù)，同時也不能對單個腫瘤細胞進行后續(xù)分析。另一個局限則是缺乏合適的肝癌細胞特異性標志物，包括經(jīng)典的肝癌標志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）。

1.2 微過濾器法（microfilters）

特定孔徑的過濾膜可使較小的細胞通過，而較大的腫瘤細胞被阻滯在膜上。早期發(fā)明的微過濾器結(jié)構(gòu)簡單，取名為ISET（isolation by size of epithelial tumor cells）[11]，最先用于循環(huán)肝癌細胞的檢測。微過濾器的優(yōu)點是可以滯留若干細胞聚集形成的循環(huán)腫瘤微栓（circulating tumor microemboli，CTM），缺點是容易丟失體積較小的腫瘤細胞[12]。而這類腫瘤細胞被證明可能更具侵襲性。

1.3 流式細胞術(shù)

由于可以通過針對細胞內(nèi)或細胞外的多個分子標志物抗體標記腫瘤細胞同時分析多個參數(shù)，在理論上流式細胞術(shù)分選腫瘤細胞具有高度特異性。但是目前常用的流式細胞術(shù)敏感性不高，分析樣品量有限，難以分選稀少的CTCs。鑒于CD90和細胞間粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1；CD54）被認為是潛在的腫瘤干細胞標志物，近來有研究報道以流式細胞術(shù)分析肝癌外周血中表達CD90和ICAM-1的細胞，并把這些細胞定義為循環(huán)肝癌干細胞[13～14]。

1.4 磁性細胞分選法

這是目前最為常用的CTCs分選方法，通常采用基于上皮細胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗體的策略分選CTCs，富集效率可達1×104～2×105倍，其中包括專業(yè)產(chǎn)品CellSearch Systern已被FDA 批準用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌、前列腺癌和結(jié)直腸癌CTCs檢測。然而遺憾的是，這一策略并不適用于分選肝癌CTCs，因為肝臟EpCAM表達譜不同于其他上皮源性器官，盡管肝臟也是一個上皮源性器官，成年人肝細胞不表達EpCAM，而臨床肝癌樣本僅有0～20%表達EpCAM[15～18]。根據(jù)肝細胞膜表面存在大量特異性去唾液酸糖蛋白受體（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的特性[19～20]，以及正常肝細胞不會出現(xiàn)在外周血的事實，我們創(chuàng)建了一種獨特的基于ASGPR及其配體相互作用的肝癌CTCs磁性分離方法，結(jié)合基于肝細胞特異性標志物Hep Par 1或上皮性腫瘤細胞標志物廣譜角蛋白的免疫熒光染色鑒定方法，形成了一種具有高度特異性的肝癌CTCs分離/檢測系統(tǒng)[21～22]。相關(guān)論文在國際抗癌聯(lián)盟等單位主辦的“Excellence in Oncology（希臘雅典，2010年11月18～20日）”會議上獲得一致好評，被大會評為最佳二等獎。檢測結(jié)果表明，健康者、良性肝病以及其他類型晚期腫瘤病例均未檢出CTCs，而80%以上HCC病例可檢測到CTCs。

2 肝癌CTCs作為肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移來源的現(xiàn)有實驗證據(jù)

目前肝癌的首選治療方法是手術(shù)切除。但術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移依然是一大難題。據(jù)文獻報道，高達40%接受肝切除術(shù)的肝癌患者第一年會發(fā)生復(fù)發(fā)，而大多數(shù)患者會因復(fù)發(fā)而死亡[23～24]。關(guān)于肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的原因，最初人們懷疑是因為沒有切除干凈引起的，于是采用了擴大腫瘤切除范圍的根治性手術(shù)方法，結(jié)果仍然發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移?；蛟S可以用肝內(nèi)腫瘤細胞通過門靜脈分支擴散或者腫瘤再生來解釋這種現(xiàn)象，但是一個典型的例子便是肝癌肝移植術(shù)，換了一個新的健康肝臟，短期內(nèi)就在移植肝上新生了肝癌。這是CTCs歸巢作為肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移來源的一個最好例證[4,24]。

我們的檢測結(jié)果表明，健康者、良性肝病以及其他類型晚期腫瘤病例均未檢出CTCs，而80%以上HCC病例可檢測到CTCs。CTCs陽性率和CTCs數(shù)目與腫瘤大小、門靜脈癌栓、TNM分期、Milan標準符合情況等具有顯著相關(guān)性。分離的CTCs被檢測到HER-2基因擴增和TP53基因缺失[21]。此外，Vona等[11]采用ISET方法檢測了44例肝癌血樣，在23例（52%）中檢出肝癌CTCs甚至微癌栓。近10多年來，腫瘤干細胞在腫瘤發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移以及治療耐受等方面的關(guān)鍵作用受到特別關(guān)注。已有一些研究提示肝癌干細胞的存在，并且鑒定出CD133、CD90、CD44、CD13、EpCAM、OV6等作為肝癌干細胞標志物[25～29]。盡管迄今還沒有一個肝癌干細胞標志物得到公認，近年來肝癌CTCs研究的一個顯著特點則是以CD90、EpCAM和ICAM-1等為肝癌干細胞標志物檢測循環(huán)肝癌干細胞。Fan等[13]采用流式細胞術(shù)檢測了82例肝癌術(shù)前血樣，發(fā)現(xiàn)56例（68.3%）可檢出CD45-CD90+CD44+細胞（被作者定義為循環(huán)肝癌干細胞）。最近Liu等[14]鑒于ICAM-1可能是一個肝癌干細胞標志物，也采用流式細胞術(shù)檢測了肝癌血樣，發(fā)現(xiàn)部分病例可檢出CD45-ICAM-1+細胞（被作者定義為循環(huán)肝癌干細胞），這樣的細胞具有較強的體外成球和體內(nèi)致瘤能力。如前所述，所有基于EpCAM的分選策略都不適用于檢測肝癌CTCs。有趣的是，EpCAM最近被認為是一個潛在的肝癌干細胞標志物。Yamashita等[30]研究結(jié)果顯示，EpCAM陽性肝癌細胞表達肝癌干細胞標志物，在體外具有克隆和球形成能力，在體內(nèi)更具致瘤性和侵襲性。在NOD-SCID鼠移植瘤模型中，只有EpCAM陽性細胞能夠產(chǎn)生侵襲性腫瘤。這些結(jié)果表明EpCAM陽性的細胞具有干細胞樣的特性，提示肝癌CTCs中含有小部分EpCAM陽性細胞可能具有自我更新能力。為此，Sun等[31]采用CellSearch System檢測了123例肝癌血樣EpCAM陽性CTCs，其中66.67%患者術(shù)前陽性，41.5%患者術(shù)前7.5 mL血可檢出≥2個EpCAM陽性CTCs。Schulze等[32]也報道了一個類似研究，發(fā)現(xiàn)30.5%（18/59）肝癌和5.3%（1/19）無HCC肝硬化血樣可檢出≥1個EpCAM陽性CTCs，其中16.5%（9/59）肝癌血樣可檢出＞1個EpCAM陽性CTCs。上述研究證據(jù)和結(jié)果提示CTCs可能是肝癌根治性術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的一個主要根源。

3 肝癌CTCs作為肝癌預(yù)后標志物的現(xiàn)有研究結(jié)果

目前少數(shù)幾個關(guān)于肝癌CTCs的臨床研究只是限于小樣本初步評價肝癌CTCs作為肝癌預(yù)后標志物的臨床意義，包括以CD90、EpCAM和ICAM-1等為肝癌干細胞標志物檢測循環(huán)肝癌干細胞。Fan等[13]在肝癌切除術(shù)前一天對82例肝癌患者采血10 mL，采用流式細胞術(shù)檢測外周血CD45-CD90+CD44+循環(huán)肝癌干細胞，然后隨訪，平均隨訪時間為13.2個月，發(fā)現(xiàn)發(fā)生復(fù)發(fā)的患者循環(huán)肝癌干細胞平均水平高于未發(fā)生復(fù)發(fā)的患者（0.02% vs. 0.01%；P＜0.0001）。如果＞0.01%，術(shù)后肝內(nèi)肝外復(fù)發(fā)的危險系數(shù)均增加。＞0.01%患者的2年無復(fù)發(fā)生存率和總體生存率均低于≤0.01%患者。因此認為CD45-CD90+CD44+循環(huán)肝癌干細胞＞0.01%可以準確地預(yù)測肝癌術(shù)后復(fù)發(fā)。Sun等[31]于術(shù)前2天及術(shù)后1個月對123名肝癌患者采血7.5 mL，采用CellSearch System檢測外周血EpCAM+CTCs，平均隨訪時間為15.1個月，結(jié)果在82例（66.67%）患者血液中檢測到1～34個EpCAM+CTCs，其中51例患者術(shù)前CTCs≥2，而后者術(shù)后發(fā)生復(fù)發(fā)早于CTCs＜2的患者。術(shù)前EpCAM+CTCs≥2則是一個獨立的預(yù)測復(fù)發(fā)的預(yù)后因子（P＜0.001)）。另外，術(shù)后1個月CTCs檢出率顯著下降。CTCs一直＜2的患者復(fù)發(fā)率低于CTCs一直≥2的患者。Schulze等[32]也采用CellSearch System檢測59例肝癌患者和19例對照患者外周血EpCAM+CTCs，將CTCs檢測結(jié)果與總體生存率、BCLC 分期、大血管與微血管侵犯以及AFP水平進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，CTCs陽性肝癌患者（18例）總體生存時間為460天，顯著低于CTCs陰性肝癌患者（746天）。不同BCLC分期的患者CTC檢出率不同，從A期～C期檢出率依次升高，具有統(tǒng)計學(xué)差異。55.6%（10/18）發(fā)生大血管侵犯以及62.5%（10/16）發(fā)生微血管侵犯的患者均可檢出CTCs。而且，CTC檢測結(jié)果與AFP水平相關(guān)，CTCs陽性患者AFP含量似乎更高。因此作者認為，EpCAM+CTCs通常存在于中晚期肝癌患者外周血中，并且與患者預(yù)后密切相關(guān)。Liu等[14]檢測了60例肝癌血樣中CD45-ICAM-1+細胞含量，其中30例（50%）循環(huán)CD45-ICAM-1+細胞＞0.157%，后者無瘤生存時間和總體生存時間明顯縮短。分析結(jié)果還表明，肝癌患者血液中高含量CD45-ICAM-1+細胞對于不良預(yù)后、門靜脈癌栓和腹水是一個獨立的危險因子。

4 肝癌CTCs臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用需要解決的技術(shù)問題

4.1 關(guān)于肝癌CTCs分離檢測的技術(shù)問題

如前所述，現(xiàn)行的分離方法各有利弊，尤其是分離發(fā)生EMT或干細胞樣CTCs受到質(zhì)疑和挑戰(zhàn)。因此，實現(xiàn)肝癌CTCs的臨床轉(zhuǎn)化需要改進現(xiàn)有技術(shù)或創(chuàng)新復(fù)合性方法，以建立一個高通量、可靠及經(jīng)濟的檢測平臺。然而，我們?nèi)匀幻媾R重大的技術(shù)挑戰(zhàn)。一個特別重要的方面是進一步發(fā)展新的CTCs捕獲方法。理想情況下，一個用于捕獲CTCs的特異性標志物應(yīng)當(dāng)表達于每個腫瘤細胞的細胞膜表面。事實上，目前并沒有這樣一個可用的生物標記物，以致于現(xiàn)有的基于生物標記物捕獲CTCs的效率和純度都不夠。因此，迫切需要尋找新的生物學(xué)或物理學(xué)標志物，以便能夠更特異、更有選擇地捕獲和檢測所有亞型的肝癌CTCs。

關(guān)于CTCs的定義也存在很多疑惑。肝癌常常是多灶性和異質(zhì)性疾病，同一個肝癌腫塊可以包含遺傳學(xué)上截然不同的細胞群，表型和功能特征可能明顯不同。現(xiàn)已明確，CTCs也具有高度異質(zhì)性以及可能發(fā)生凋亡，甚至同一個患者的CTCs存在顯著異質(zhì)性[33]。這使得準確定義CTCs變得困難。由于每個參數(shù)可能存在于正常對照或同時為白細胞所具有，目前還沒有這樣一個單個參數(shù)，比如大小、細胞學(xué)形態(tài)、生物標記物的病理染色，足以定義“真正的”CTCs。此外，由于缺乏一個可檢測特點，如EpCAM、CKs和AFP，或由于在操作過程中細胞破壞或丟失，有些CTCs亞型可能不能被現(xiàn)有檢測技術(shù)檢測出來。也許重要的是，特異性和靈敏度可能并不僅限于技術(shù)方面，生物學(xué)方面也應(yīng)該引起重視。總之，目前的現(xiàn)狀是，并不是所有被檢測到的細胞都是惡性細胞，也并不是所有惡性細胞都能被檢測到。因此，不同的CTCs定義可能產(chǎn)生不同的CTCs計數(shù)，從而具有不同的臨床意義。顯然，一個“標準”的或“唯一”的CTCs定義在臨床上是很重要的。

4.2 關(guān)于肝癌CTCs分子鑒定的技術(shù)問題

如前所述，CTCs是一個高度異質(zhì)性群體，不同的CTCs亞型可能存在不同特點。CTCs計數(shù)只是證實其是一個腫瘤細胞，而基于分子鑒定檢測少數(shù)更具存活力、侵襲性和轉(zhuǎn)移能力的CTCs比單獨CTCs計數(shù)可能更有價值。已知CTCs在歷經(jīng)侵襲、轉(zhuǎn)移各個階段的過程中，需要獲得上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、干細胞特性、逃逸免疫監(jiān)視、抵抗失巢凋亡、耐受治療等生物學(xué)特性，才能闖過層層難關(guān)生存下來并增殖，最終形成遠處轉(zhuǎn)移灶。而上述每個生物學(xué)特性的分子機制都可被用來進行腫瘤分子分型，并且可能成為個體化腫瘤診療的靶點。然而，CTCs分子表型鑒定及其臨床意義的研究尚處于起步階段。CTCs分子鑒定不僅需要高敏感和高特異的CTCs分離方法，而且需要針對單細胞或稀少細胞的分子分析技術(shù)。而現(xiàn)有的常用CTCs分子鑒定方法也存在一定的局限，比如，針對蛋白標志物的免疫學(xué)檢測方法敏感性或特異性不夠；針對核酸標志物的PCR等檢測技術(shù)需要破壞CTCs結(jié)構(gòu)，無法觀察細胞形態(tài)學(xué)以及計數(shù)靶細胞，更不能對靶細胞進行后續(xù)的細胞培養(yǎng)與藥敏實驗等。而解決CTCs高度異質(zhì)性問題的技術(shù)策略則是對單個CTCs進行分子鑒定和比較分析。目前已有一些這樣的嘗試[34～35]。相信這會成為未來的一個研究趨勢。

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Research progress and upcoming challenges of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma

ZHANG Yu, YANG Xia, YIN Zhengfeng★
(Molecular Oncology Laboratory, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China)

Recurrence or metastasis is the major cause of mortality in the patients with hepatocellular carcinoma (HCC) who underwent hepatectomy. Circulating tumor cells (CTCs) disseminated from the primary tumor into the peripheral blood are increasingly recognized as the main source of recurrence and metastasis. In the past decade, with the tremendous progress in the technology of CTC detection, there is convincing evidence that CTCs have great potential as a marker for metastatic disease and poor prognosis in patients with a malignancy. However, probably due to the inability of current commercial methods to capture HCC cells, few studies examining CTC counts have been conducted on HCC patients so far, and knowledge about clinical relevance of CTC detection in HCC is lagging behind other major tumor diseases. Fortunately, some interesting and encouraging results have been recently achieved in the HCC CTC detection, and the situation has started to change for HCC. Here we will outline the different approaches available for HCC CTCs, review clinical studies on CTC detection in HCC patients, and formulate upcoming challenges and technical aspects in this field.

Hepatocellular carcinoma; Circulating tumor cells; Recurrence and metastasis; Prognosis

國家傳染病重大專項基金（2012ZX10002012-010）；國家自然科學(xué)基金（81172207，81272669）

第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院分子腫瘤研究室，上海 200438

★通訊作者：殷正豐，E-mail:yinzfk@aliyun.com