張 亞， 馮志新， 姚景霆，3， 華利忠， 甘 源， 劉占軍， 韋艷娜， 邵國青

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室，國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210095;3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 太谷 030801)

隨著人們對黏膜免疫認識程度的加深，黏膜免疫系統(tǒng)的研究不僅為傳統(tǒng)的免疫學(xué)增加新內(nèi)容，也為很多疾病的致病機理、病原與宿主的關(guān)系、疾病診治及新型疫苗與預(yù)防制劑等的研究提供了思路與方法。黏膜免疫和黏膜一起構(gòu)成了機體防御外來病原入侵的第一道屏障［1］。黏膜免疫產(chǎn)生的抗體主要以分泌型的IgA(SIgA)為主［2］。研究表明，SIgA抗體在抵御病原體的感染過程中起到了重要的作用［3］。利用感染敲除基因的小鼠模型試驗證實了SIgA在對許多傳染性病原的保護和交叉保護中起到了重要的作用［4］。因此，黏膜表面總IgA或特異性IgA已成為了疾病診斷和一些疫苗免疫效果評價的一個重要指標。在人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，黏膜分泌物如鼻拭子、陰道拭子、唾液等因為采集簡單，對機體損傷小的優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用到疾病的臨床檢測中［5-7］。由于采集及處理方式的不同，黏膜分泌物樣本之間存在較大差異。為了保證不同樣本之間具有可比性，許多對黏膜特異性IgA抗體的研究都以總IgA作為校準標準。為定量檢測豬呼吸道、消化道等黏膜表面的分泌性IgA抗體，本研究利用1株豬IgA單克隆抗體與羊抗豬IgA的多克隆抗體建立了雙抗夾心ELISA檢測方法，為豬的黏膜免疫研究提供基礎(chǔ)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

140份鼻拭子樣本來自臨床健康豬(明天牧業(yè)有限公司南京六合豬場提供)，陽性豬肺泡灌洗液來自臨床健康豬(明天牧業(yè)有限公司南京六合豬場提供)，陰性對照豬肺泡灌洗液樣本來自剛出生仔豬(未吃初乳)，豬IgA蛋白質(zhì)(由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室提供)［8］，鼠抗豬IgA單抗(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點實驗室提供)［8］，96孔酶標板(深圳金燦華實業(yè)有限公司)，羊抗豬IgA-HRP購自BETHYL公司，標準分子量蛋白Marker購自生興生物公司，其他化學(xué)試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器

酶標儀(Bio-Rad)，微量移液器(Thermo)，高速冷凍離心機(Sigma)。

1.3 方法

1.3.1 雙抗夾心ELISA方法的建立 以鼠抗豬IgA單抗作包被抗原，HRP標記的羊抗豬IgA抗體作為檢測二抗，建立豬IgA的雙抗夾心ELISA檢測方法。以方陣滴定法分別確定包被抗體的最佳稀釋度和工作條件、最適封閉液和作用時間、酶標抗體的最佳稀釋度和作用時間、底物溶液的最佳反應(yīng)時間。建立ELISA的最佳試驗條件。

1.3.2 標準曲線的建立 以豬IgA蛋白質(zhì)為標準品，將其依次 稀 釋 成 250.0 μg/L、125.0 μg/L、62.5 μg/L、31.3 μg/L、15.6 μg/L、7.8 μg/L、4.0 μg/L、2.0 μg/L、1.0 μg/L、0.5 μg/L，按照已確定的ELISA最佳試驗條件進行檢測，同時設(shè)定樣品稀釋液為陰性對照，TBST為空白對照，平行測定20次。以標準蛋白質(zhì)IgA的質(zhì)量濃度為自變量，其所對應(yīng)的OD450值減去空白OD450值為應(yīng)變量，利用ELISACalc數(shù)據(jù)分析軟件繪制標準曲線。確定標準曲線的最低檢測限和線性范圍。

1.3.3 重復(fù)性試驗 隨機抽取3個批次的豬肺泡灌洗液樣本，同時進行批內(nèi)和批間檢測，批內(nèi)設(shè)2個平行。批間設(shè)10個平行，設(shè)置陰性對照和空白對照。對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。

1.3.4 臨床豬鼻拭子中總IgA含量的測定 用本試驗建立的雙抗夾心ELISA檢測方法對140份臨床豬鼻拭子樣本中總IgA含量進行測定。

2 結(jié)果

2.1 雙抗夾心ELISA的工作條件

經(jīng)方陣滴定法優(yōu)化并確定ELISA工作條件:鼠抗豬IgA單抗作包被抗原，包被濃度為 1 μg/ml，每孔 100 μl，37 ℃孵育1 h后4℃過夜，棄去孔內(nèi)液體，每孔加pH 7.4 PBST 350 μl，靜止5 min，然后再甩掉拍干，如此反復(fù)洗滌3次，最后一次拍干后，每孔加1%酪蛋白質(zhì)200 μl，于37℃封閉2 h，如上述方法洗滌3次;每孔加檢測樣本100 μl(鼻拭子樣本稀釋至1∶500和1∶2 000 2個稀釋度，每個稀釋度重復(fù)3孔)，37℃作用1 h;洗滌3次后，每孔加入經(jīng)1∶15 000稀釋的羊抗豬IgA-HRP 100 μl，37℃作用1 h。洗滌5次，每孔加100 μl TMB顯色底物，顯色時間 5 min，最后，每孔加50 μl 2 mol/L H2SO4終止液，讀取OD450數(shù)值。

2.2 標準曲線

根據(jù)對不同濃度豬IgA蛋白質(zhì)標準品檢測結(jié)果，繪制標準曲線。該曲線為4參數(shù)Logstic擬合;方程:Y=(A－D)/［1+(x/C)^B］+D，其中 A=2.011 18，B= －1.213 78，C=28.741 16，D=0.031 20，R2=0.997 41，從結(jié)果可以看出:最低檢測限為2.0 ng/ml;檢測范圍為2.0～250.0 ng/ml。

2.3 重復(fù)性試驗

隨機抽取3個批次的豬肺泡灌洗液樣本，分別進行批內(nèi)和批間檢測。結(jié)果顯示，批內(nèi)試驗的變異系數(shù)為0.503%～7.946%;批間試驗的變異系數(shù)為0.457% ～4.722%。

2.4 臨床鼻拭子樣本中總IgA含量

用本試驗建立的雙抗夾心ELISA方法對140份鼻拭子樣本進行檢測，結(jié)果顯示鼻拭子總IgA量為(25.84±4.22)μg/ml。

3 討論

本研究建立的雙抗夾心ELISA檢測方法檢測豬IgA抗體蛋白質(zhì)，以豬IgA蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，將各質(zhì)量濃度逐點連接，所得曲線呈弧形分布，曲線中部斜率適中，是最理想的檢測區(qū)域，所以最后所確定的標準品的最適稀釋比例應(yīng)落在這個區(qū)域中。最終，本試驗建立的雙抗夾心ELISA檢測方法的最低檢測限為2.0 ng/ml;檢測范圍為 2.0 ～250.0 ng/ml。

豬呼吸道IgA蛋白質(zhì)雙抗夾心ELISA檢測方法的建立及其在豬呼吸道樣本總IgA濃度檢測中的應(yīng)用為豬黏膜免疫應(yīng)答機制的研究提供一種可行的檢測手段。

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