穆慶，許艷麗，陳鵬，王丹波

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院，遼寧沈陽(yáng) 110004)

子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥)是婦科常見(jiàn)病及難治病，其發(fā)病機(jī)制研究一直是婦科的臨床研究熱點(diǎn)之一。近年來(lái)，“在位內(nèi)膜決定論”受到關(guān)注，即內(nèi)異癥患者在位子宮內(nèi)膜的基因異常是內(nèi)異癥發(fā)生的重要原因，但在位內(nèi)膜的特異性靶基因尚未揭曉。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，cofilin-1基因(CFL1)是內(nèi)異癥在位內(nèi)膜差異表達(dá)基因之一［1］，并證明在位內(nèi)膜CFL1高表達(dá)，促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞黏附、增殖及新血管生成，發(fā)生內(nèi)異癥［2-3］，但其作用機(jī)制尚待進(jìn)一步證明。血小板源性生長(zhǎng)因子(platelet derived growth factor，PDGF)已被證實(shí)在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜的增殖中起重要作用，本研究將探討CFL1與PDGF在內(nèi)異癥中的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 組織收集和細(xì)胞培養(yǎng)

選擇中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院高期別卵巢內(nèi)異癥行子宮全切術(shù)患者12例(37～49歲)，樣本采集經(jīng)中國(guó)醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并獲得患者的知情同意。所有患者在術(shù)前6個(gè)月未接受GnRH類藥物、激素類藥物及抗炎藥物治療。根據(jù)既往月經(jīng)周期及組織學(xué)檢查確定為分泌期標(biāo)本。術(shù)中即時(shí)獲得在位子宮內(nèi)膜組織處理及ESC培養(yǎng)方法與既往相關(guān)研究［2］相同。經(jīng)單層培養(yǎng)的ESC在第3代起可以達(dá)到99%的純度，第3代細(xì)胞將用于后續(xù)試驗(yàn)。

1．2 PDGF 實(shí)驗(yàn)

單層培養(yǎng)的ESC在第2代鋪滿培養(yǎng)瓶底后傳代為第3代按6孔板每孔105個(gè)細(xì)胞數(shù)接種，培養(yǎng)48 h后，培養(yǎng)液換成無(wú)血清的DMEM/F12孵育24 h。在12例 ESC 細(xì)胞中加入10 ng·ml－1PDGF(R＆D Systems，Minneapolis，MN，USA)分別作用 3、6、12 h。另外，在12 例 ESC 細(xì)胞中分別加入 1.0、10、100 ng·ml－1的PDGF作用6 h，以PBS代替PDGF作為0濃度組。

1．3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

使用 Trizol試劑(TaKaRa，Otsu，Shiga，Japan)從來(lái)自于各組相同數(shù)量的細(xì)胞中提取RNA，按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求的標(biāo)準(zhǔn)無(wú)酶操作進(jìn)行。按SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR 試劑盒 (TaKaRa，Otsu，Shiga，Japan)的逆轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。CFL1引物序列為:5'-TGCCTGAGTGAGGACAAG-3'(正義鏈)，5'-GACAAAGGTGGCGTAGGG-3'(反義鏈)。內(nèi)參照磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)，引物序列為:5'-GCACCG TCAAGGCTGAGAAC-3'(正義鏈)，5'-ATGGTGGTGAA GACCCAGT-3'(反義鏈)。在 LightCycler Real Time PCR擴(kuò)增儀(ABI公司)上按照SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒(TaKaRa公司)的使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR循環(huán)參數(shù)為:95℃ 15 s，60℃ 1 min，共45 個(gè)循環(huán)。CFL1 mRNA 水平以2－△△CT［4］方法計(jì)算，同時(shí)為保證mRNA水平不受細(xì)胞數(shù)量影響，反轉(zhuǎn)錄按照20 μl體系進(jìn)行，總RNA定量為1 000 ng，并且所有標(biāo)本均同一批次反轉(zhuǎn)錄。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

鏡下觀察PDGF處理前后ESC形態(tài)學(xué)無(wú)明顯改變。10 ng·ml－1PDGF 分別作用 ESC 0、3、6、12 h，ESC中CFL1 mRNA的水平隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上調(diào)，各組CFL1 mRNA表達(dá)相對(duì)水平分別為1.09±0.13、1.61±0.24、2.31±0.30和 3.61±0.60，與 0 h組比較，6 h和12 h組表達(dá)增高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 PDGF處理后ESC時(shí)間依賴性CFL1 mRNA表達(dá)Fig 1 CFL1 mRNA expression of ESC treated with PDGF in a time-dependent manner

以1、10、100 ng·ml－1PDGF 分別作用 ESC 6 h 與未進(jìn)行PDGF處理(PBS代替PDGF)的ESC比較，隨著處理劑量的增加CFL1 mRNA的水平也顯著上調(diào)，各組CFL1 mRNA表達(dá)相對(duì)水平分別為1.78±0.36、2.43±0.41和3.87±0.84，與未處理組(1.09±0.13)相比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討 論

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生與異位內(nèi)膜細(xì)胞較強(qiáng)的黏附、增殖及新血管生成等生物學(xué)功能密切相關(guān)?！霸谖粌?nèi)膜決定論”是近年來(lái)子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生機(jī)制的熱點(diǎn)理論［5］，已證實(shí)內(nèi)異癥患者在位內(nèi)膜細(xì)胞黏附、增殖及新血管生成的相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)異常，其中PDGF是重要候選基因之一。PDGF是活化的巨噬細(xì)胞的特征性分泌產(chǎn)物，是成纖維細(xì)胞和血管形成前體細(xì)胞有效的促有絲分裂劑［6-7］。PDGF對(duì)多種腫瘤細(xì)胞增殖血管形成有重要作用［8-9］，同時(shí)內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞增殖也呈現(xiàn)了明顯的劑量依賴性。此外，PDGF是內(nèi)異癥異位病變血管形成過(guò)程的關(guān)鍵部分［10］。因此，PDGF可能是與內(nèi)異癥發(fā)病機(jī)制相關(guān)的關(guān)鍵因素。

圖2 PDGF處理后ESC濃度依賴性CFL1 mRNA表達(dá)Fig 2 CFL1 mRNA expression of ESC treated with PDGF in dose-depentdent manner

CFL1是普遍表達(dá)的細(xì)胞骨架蛋白，屬于肌動(dòng)蛋白解聚因子家族，在促進(jìn)肌動(dòng)蛋白解聚/聚合過(guò)程和肌動(dòng)蛋白片段的迅速轉(zhuǎn)換中具有重要角色［11］。肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的重組對(duì)腫瘤進(jìn)展、細(xì)胞動(dòng)力、細(xì)胞黏附、細(xì)胞侵襲和血管形成均十分關(guān)鍵［12］。CFL1的基本功能與內(nèi)異癥的生物學(xué)特點(diǎn)高度一致，同時(shí)本研究組前期對(duì)內(nèi)異癥在位內(nèi)膜上調(diào)基因篩查發(fā)現(xiàn)，CFL1是在位內(nèi)膜上調(diào)候選基因之一［1］，經(jīng)過(guò)全面驗(yàn)證，CFL1過(guò)度表達(dá)在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞的黏附、增殖及血管生成中起重要作用［2-3］。因此，CFL1在內(nèi)異癥中的作用機(jī)制研究成為本課題組進(jìn)一步研究重點(diǎn)，而PDGF與CFL1的調(diào)控關(guān)系值得關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ESC中CFL1 mRNA的表達(dá)隨著PDGF作用時(shí)間延長(zhǎng)而增加，隨PDGF濃度增高而增加。因此，PDGF可能是CFL1表達(dá)的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，PDGF對(duì)于內(nèi)異癥發(fā)生、發(fā)展的影響可能與CFL1相關(guān)。肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)與細(xì)胞增殖直接相關(guān)［13］，并且增殖起源于肌動(dòng)蛋白的重組［14］，CFL1 正是肌動(dòng)蛋白解聚因子家族成員，因此CFL1直接促進(jìn)細(xì)胞的增殖。研究顯示，PDGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖與RhoA-ROCK信號(hào)途徑相關(guān)［15］。CFL1是RhoA-ROCK信號(hào)途徑的下游信號(hào)分子?？梢酝茰y(cè)，PDGF對(duì)于內(nèi)異癥在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖調(diào)控可能通過(guò)RhoA-ROCK信號(hào)途徑對(duì)CFL1的調(diào)控實(shí)現(xiàn)。CFL1表達(dá)的改變可能對(duì)PDGF誘導(dǎo)的ESC增殖十分必要，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。Hu等［16］研究發(fā)現(xiàn)，PDGF激活PI3K通路可促進(jìn)肌動(dòng)蛋白重組，定向細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，刺激細(xì)胞生長(zhǎng)，并抑制細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，豬腎小管上皮細(xì)胞［17］中PI3K通路的激活可以使SSH1活化，進(jìn)一步通過(guò)使CFL1去磷酸化而具有活性。因此，進(jìn)一步研究子宮內(nèi)異癥患者PDGF調(diào)控CFL1的具體信號(hào)通路，有助于通過(guò)阻斷某一通路，達(dá)到靶基因治療內(nèi)異癥的目的。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在內(nèi)異癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中，PDGF可能是CFL1基因表達(dá)的強(qiáng)誘導(dǎo)劑，而且與作用時(shí)間、濃度均有關(guān)系，但具體通路有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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