劉杏娥

姜黃素抑制刺猬信號誘導(dǎo)小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡

劉杏娥

目的 探討姜黃素對小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞的作用及可能機(jī)制。方法 不同濃度（5、10、15μmol/L）的姜黃素作用于小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞后，采用MTT法檢測細(xì)胞增殖，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，Western blot技術(shù)檢測索尼克刺猬信號（Shh）、腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1（Gli1）的表達(dá)水平。結(jié)果 不同濃度的姜黃素與小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞共培養(yǎng)后，濃度為15μmol/L的姜黃素能明顯抑制NCI-H446細(xì)胞的增殖。與其余各組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。小細(xì)胞肺癌NCI-H446細(xì)胞經(jīng)姜黃素處理后，姜黃素15μmol/L與其余各組比較，細(xì)胞凋亡率的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。經(jīng)姜黃素（15μmol/L）處理的NCI-H446細(xì)胞，Shh和Gli1表達(dá)均明顯降低，與對照組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。結(jié)論 姜黃素能通過抑制刺猬信號通路，抑制小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。

姜黃素 小細(xì)胞肺癌 刺猬

姜黃素是一種從姜科植物姜黃中提取的酚化合物，具有強(qiáng)烈的抗炎、抗氧化、抗突變等特性。近年來的研究表明,姜黃素可通過多種機(jī)制抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)其凋亡，并能提高其對化療藥物和放療的敏感性[1-2]。刺猬信號通路由刺猬配體、兩個跨膜蛋白受體patched（Ptch）、smoothened（Smo）以及下游轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白等組成。刺猬信號通路在胚胎發(fā)育、組織修復(fù)及癌癥發(fā)生等進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，刺猬通路的異常激活與肺癌的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[4-5]。本文通過研究姜黃素對小細(xì)胞肺癌SCLC NCI-H446細(xì)胞體外增殖、細(xì)胞凋亡等影響，同時檢測索尼克刺猬信號（sonic hedgehog，Shh）、腦膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因1（glioma associated oncogene 1，Gli1）蛋白表達(dá)水平，探討姜黃素對SCLC細(xì)胞的作用及可能的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 SCLC NCI-H446細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞所。姜黃素購自美國Sigma公司。兔抗人Shh、Gli1一抗購自美國Cell Signaling公司產(chǎn)品，鼠抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。Annexin V/PI凋亡檢測試劑盒購自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。DMEM、胎牛血清購自美國GIBCO公司。MTT購自美國Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜黃素儲備液 稱取姜黃素368.38mg溶于無水乙醇40ml中，得姜黃素25mM保存。使用前取0.5ml儲備液加0.75mlDMEM培養(yǎng)液制成10mM工作液。

1.2.2 姜黃素抑制SCLC細(xì)胞增殖的實驗研究 采用MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率：NCI-H446細(xì)胞經(jīng)DMEM常規(guī)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化后,以1×104/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，37℃過夜。將細(xì)胞分為姜黃素5、10、15μmol/L處理組及對照組，培養(yǎng)48h后將96孔板中的細(xì)胞以500g離心3min，棄100μl上清液，加MTT 10μl（5mg/ml），37℃孵育4h，加DMSO 100μl，震蕩10min后上酶標(biāo)免疫測定儀檢測OD490值。計算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率=（1-處理組A值/對照組A值）×100%。

1.2.3 姜黃素誘導(dǎo)SCLC細(xì)胞凋亡的實驗研究 采用Annexin V-FITC/PI雙染色法，按試劑盒說明書操作：NCI-H446細(xì)胞經(jīng)DMEM常規(guī)培養(yǎng)后用0.25%胰酶消化，以1×105/ml接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，將細(xì)胞分姜黃素5、10、15μmol/L處理組及對照組。經(jīng)48h處理后胰酶消化收集細(xì)胞，800g離心5min，再經(jīng)PBS洗3次，分別加緩沖液50μl、V-FITC 5μl、PI 10μl，避光5min以上，進(jìn)行流式細(xì)胞檢測。

1.2.4 姜黃素對Shh、Gli1表達(dá)的影響 采用Western blot技術(shù)檢測Shh、Gli1的表達(dá)水平：NCI-H446細(xì)胞經(jīng)DMEM常規(guī)培養(yǎng)后用0.25%胰酶消化,以1×105/ml接種于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)過夜，將細(xì)胞分為姜黃素15μmol/L處理組及對照組，48h后收集各組細(xì)胞，一步法裂解細(xì)胞后以13 000r/min高速離心10min，取上清液進(jìn)行蛋白定量。常規(guī)制備10%SDS-PAGE分離膠和積層膠。每孔上樣蛋白量50μg，加4×上樣緩沖液，混勻后煮沸5min，上樣后100V電泳至染料跑出膠。輕輕取下膠，用Millipore H2O洗膠1次，100V轉(zhuǎn)膜2h，用封閉液37℃封閉2h，加入相應(yīng)的一抗（1∶1 000）4℃過夜，TBST洗膜4次，10min/次，加辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫1h，TBST洗膜4次，10min/次，最后加ECL液曝光顯色。結(jié)果用Band Leader軟件進(jìn)行條帶灰度半定量分析。1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 MTT增殖試驗 姜黃素5、10、15μmol/L處理組的NCI-H446細(xì)胞增殖抑制率為（14.61±2.94）%、（17.24± 2.91）%、（58.34±4.91）%。隨著姜黃素濃度的逐漸增加，NCI-H446細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸增加，姜黃素5、10μmol/L處理組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；而姜黃素15μmol/L處理組與姜黃素5、10μmol/L和對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。

2.2 細(xì)胞凋亡檢測 姜黃素5、10、15μmol/L處理組的NCI-H446細(xì)胞凋亡率分別為（3.29±0.26）%、（3.86± 0.33）%及（27.31±1.42）%，對照組為（2.80±0.31）%（圖1）。姜黃素15μmol/L處理組較5、10μmol/L處理組及對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

2.3 姜黃素抑制NCI-H446細(xì)胞Shh、Gli1的表達(dá) 見圖2、3。

圖3 姜黃素15μmol/L處理組、對照組Shh、Gli1的半定量比值對比圖（1：姜黃素15μmol/L處理組；2：對照組）

由圖3可見，在姜黃素15μmol/L處理組Shh、Gli1蛋白表達(dá)水平均較對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=7.44、5.94，均P=0.000）。

3 討論

SCLC是肺癌的一個未分化癌分型，在肺癌中所占的比例約15%～20%，SCLC分為局限期和廣泛期，大多數(shù)SCLC診斷時已為廣泛期，局限期最多占1/3。小細(xì)胞肺癌的細(xì)胞倍增時間短，進(jìn)展快，常伴內(nèi)分泌異常或類癌綜合征，早期即發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，可手術(shù)的患者僅占全部患者的5%，故SCLC的治療以全身化療為主。盡管新藥不斷涌現(xiàn)，但并沒有明顯改善SCLC的預(yù)后。靶向治療近年來不斷地改寫NSCLC的臨床治療策略，但令人失望的是SCLC的靶向治療至今尚無突破。

姜黃素刺猬信號通路是一條高度保守的信號傳導(dǎo)通路，主要由信號分子刺猬、Ptch、Smo和下游的核轉(zhuǎn)錄因子Gli組成。Gli的靶基因涉及到腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、轉(zhuǎn)移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、新生血管形成等多個方面[6]。近年來的研究表明，刺猬或Gli信號通路在SCLC中常持續(xù)異?；罨赟CLC的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用[7]。

姜黃素因具有預(yù)防腫瘤、抑制腫瘤、放化療增敏等多種作用，近年來在腫瘤領(lǐng)域受到極大關(guān)注。研究表明，姜黃素對多種腫瘤細(xì)胞，包括乳腺癌、胃癌、大腸癌、肺癌、胰腺癌等均具有化學(xué)預(yù)防及治療作用[8-9]。姜黃素抗腫瘤作用的機(jī)制主要是通過調(diào)節(jié)多條信號通路分子，如下調(diào)EGFR、HER-2、Wnt/β-catenin及其下游信號分子ERK、AKT、NF-κB、STATs等，上調(diào)p21、p27、細(xì)胞周期激酶抑制劑等[10-13]。

我們研究了姜黃素對SCLC細(xì)胞NCI-H446的增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度的姜黃素與SCLC細(xì)胞NCI-H446共培養(yǎng)后，隨著姜黃素濃度的逐漸增加，NCI-H446細(xì)胞的增殖抑制也逐漸增加，濃度為15μmol/L的姜黃素可明顯抑制NCI-H446細(xì)胞的增殖。NCI-H446細(xì)胞經(jīng)姜黃素處理后，細(xì)胞凋亡率明顯高于對照組。這提示姜黃素可在體外誘導(dǎo)NCI-H446細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)姜黃素處理后，NCI-H446細(xì)胞Shh和Gli1的表達(dá)水平明顯下降。Gli蛋白是Smo下游的轉(zhuǎn)錄因子，在刺猬通路中起關(guān)鍵作用。Gli1也是刺猬信號活化后的靶基因，Gli1表達(dá)下降，提示刺猬信號通路被抑制。

本研究結(jié)果提示，姜黃素能抑制SCLC細(xì)胞NCIH446的體外增殖，并可能通過抑制細(xì)胞刺猬信號通路的信號分子Shh、Gli1表達(dá)誘導(dǎo)NCI-H446細(xì)胞的凋亡。姜黃素作用48h后，NCI-H446細(xì)胞中的Shh、Gli1蛋白表達(dá)水平均降低，這些結(jié)果提示姜黃素可抑制刺猬信號分子的活化。

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Curcumin induces apoptosis of small cell lung cancer cells by inhibiting Hedgehog signaling pathway

Objective To investigate the effects of curcumin on small cell lung cancer cells and the possible molecular mechanisms．Methods The cultured small cell lung cancer NCI-H446 cells were treated with concentrations of curcumin,the cell proliferation was measured by MTT assay,apoptosis was detected by flow cytometery,the expressive level of Shh and GLI1 were detected by Western blot．Results Curcumin(15μmol/L)significantly inhibited the growth of NCI-H446 cells(P＜0．01)and induced cell apoptosis(P＜0．01)．The expressive levels of Shh and GLI1 in curcumin treated groups were significantly reduced compared to those in control group(P＜0．01)．Conclusion Curcumin can inhibit proliferation and induce apoptosis of small cell lung cancer cells by inhibiting Hedgehog signaling pathways．

Curcumin Small cell lung cancer Hedgehog

2012-08-27）

（本文編輯：楊麗）

310013 杭州，浙江醫(yī)院腫瘤科