馬紀(jì)林 劉小賢 汪衛(wèi) 鄭紅霞 蔡龍 施華萍 周紅娟 于健寧

●論 著

初發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Th17細(xì)胞的檢測(cè)及意義

馬紀(jì)林 劉小賢 汪衛(wèi) 鄭紅霞 蔡龍 施華萍 周紅娟 于健寧

目的 觀察初發(fā)系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）和Th17細(xì)胞的變化，探討其臨床意義。方法 檢測(cè)15例初發(fā)SLE患者（活動(dòng)組11例，非活動(dòng)組5例）及10例健康對(duì)照者（對(duì)照組）的外周血CD4+CD25highTreg、Th17細(xì)胞占CD4+的比例，分析兩種細(xì)胞的比率與疾病活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）的相關(guān)性。結(jié)果 初發(fā)SLE患者外周血CD4+CD25highTreg和Th17細(xì)胞的比例與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），與SLEDAI無相關(guān)性（均P＞0．05）。CD4+CD25highT細(xì)胞與Th17細(xì)胞的比率在活動(dòng)組患者下降尤為明顯（P＜0．05），且與SLEDAI呈明顯的負(fù)相關(guān)（P＜0．05）。 結(jié)論 初發(fā)的活動(dòng)性SLE患者外周血Treg與Th17細(xì)胞的比率明顯下降，并與疾病活動(dòng)密切相關(guān)，兩群細(xì)胞的失衡可能在SLE發(fā)病機(jī)制中起重要的作用。

紅斑狼瘡 系統(tǒng)性 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞 Th17細(xì)胞

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是具體病因尚未明確的一種常見的自身免疫性疾病，臨床特征為抗原-抗體的免疫復(fù)合物沉積于器官引起多種臨床表現(xiàn)。免疫系統(tǒng)紊亂在SLE發(fā)病中占主導(dǎo)地位。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulaory T cells，Treg）和Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的兩群CD4+T細(xì)胞亞群，其中Treg具有免疫抑制和免疫無能的特征，可“主動(dòng)”地抑制免疫反應(yīng)[1]。Th17細(xì)胞為促炎癥細(xì)胞，通過分泌IL-17A和IL-17F，引起組織的免疫炎癥[2-3]。兩群細(xì)胞間的失衡導(dǎo)致自身免疫病的發(fā)生[4]。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)Treg與Th17的失衡在活動(dòng)性SLE中明顯降低，并與疾病明顯相關(guān)，但在初發(fā)SLE患者中的作用尚不明確[5]。本研究采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)初發(fā)SLE患者外周血CD4+CD25high-Treg和Th17細(xì)胞占CD4+細(xì)胞的比例，分析兩者的比率與疾病活動(dòng)的相關(guān)性以及Treg與Th17細(xì)胞的免疫失衡在初發(fā)SLE發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 我院風(fēng)濕免疫腎臟科2008-09—2011-12住院或門診收治未經(jīng)治療的初發(fā)SLE患者15例，男1例，女14例，年齡22～38歲。診斷均符合1997年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)制定的SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)。采用SLE疾病活動(dòng)指數(shù)（SLEDAI）將其分組（SLEDAI≈6分為活動(dòng)組，＜6分為非活動(dòng)組），其中活動(dòng)組10例，SLEDAI為（14.70±5.12）分，非活動(dòng)組5例，SLEDAI為（2.60±1.14）分，兩組評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。選擇同時(shí)期體檢的健康者10例為對(duì)照組，男1例，女9例，年齡20～37歲。兩組性別、年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。本研究遵循倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并得到本單位醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CD4+CD25highT細(xì)胞的培養(yǎng)與標(biāo)記 取肝素抗凝全血3ml，分別加入20μl的PE標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗和異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的鼠抗人CD25單抗，并設(shè)立同型對(duì)照管?；靹蚝蟊芄?5min，再加入1ml紅細(xì)胞裂解液，37℃孵育10min，離心棄去上清液，PBS洗滌3次。

1.2.2 Th17細(xì)胞的培養(yǎng)與標(biāo)記 空腹抽取初發(fā)SLE患者和健康對(duì)照組靜脈血，肝素抗凝，調(diào)整細(xì)胞濃度為1× 106個(gè)/ml，接種至24孔培養(yǎng)板，每孔加入的50ng/ml佛波酯和750ng/ml的離子霉素，孵育1h后加入10μg/ml莫能霉素，在37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育4h后收集細(xì)胞，取500μl細(xì)胞于流式專用試管中，分為測(cè)定管和同型對(duì)照管，加入20μl的PE標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗，4℃避光孵育30min，PBS洗滌2次，固定液室溫避光固定反應(yīng)20min后離心棄去上清液，PBS洗滌2次。加入破膜劑進(jìn)行細(xì)胞打孔，離心棄去上清液后進(jìn)行細(xì)胞因子染色。測(cè)定管加入0.5μl FITC標(biāo)記的IL-17A，對(duì)照管加入同型對(duì)照，4℃避光孵育30min。藻紅素（PE）標(biāo)記的鼠抗人CD4，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人CD25及同型對(duì)照均購(gòu)自美國(guó)BD公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的鼠抗人的IL-17A及同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司。佛波酯、離子霉素和莫能霉素均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，RPMI 1640購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè) Epics XL-MCL型流式細(xì)胞分析儀（Beckman-Coulter公司），按常規(guī)操作進(jìn)行，EXPO32軟件分析結(jié)果，根據(jù)正向散射光和側(cè)向散射光以淋巴細(xì)胞群設(shè)門，分別測(cè)定SLE患者和健康對(duì)照組CD4+CD25highT細(xì)胞和Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例，其中CD4+CD25highT細(xì)胞定義為2倍于CD4+CD25+T細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度的細(xì)胞（圖1）。

圖1 流式檢測(cè)CD4+CD25highT細(xì)胞的設(shè)門

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SigmaStat3.5統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析（AVONA），兩組間比較采用t檢驗(yàn)，變量間的相關(guān)關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié)果

初發(fā)SLE患者及對(duì)照組外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的比率及與疾病的相關(guān)性 見表1。

由表1可見，初發(fā)SLE組和對(duì)照組外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞的比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中在初發(fā)SLE患者中，活動(dòng)組和非活動(dòng)組外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞的比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?；顒?dòng)組和非活動(dòng)組SLE與對(duì)照組比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。初發(fā)SLE患者外周血CD4+CD25highT細(xì)胞的比例與SLEDAI無相關(guān)性（r=-0.403，P＞0.05，圖2A）。

表1 初發(fā)SLE組與對(duì)照組的Treg和Th17細(xì)胞的比例及兩者的比率

初發(fā)SLE組和對(duì)照組外周血Th17細(xì)胞的比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中在初發(fā)SLE患者中，活動(dòng)組、非活動(dòng)組外周血Th17細(xì)胞的比例比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），活動(dòng)組、非活動(dòng)組與對(duì)照組比較，差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。初發(fā)SLE患者外周血Th17細(xì)胞的比例與SLEDAI無相關(guān)性（r= 0.471，P＞0.05，圖2B）。

圖2 CD4+CD25highT細(xì)胞（A）和Th17細(xì)胞（B）與SLEDAI的相關(guān)性分析

初發(fā)SLE組和對(duì)照組外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。其中在初發(fā)SLE患者中，活動(dòng)組、非活動(dòng)組外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的比率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。初發(fā)SLE患者CD4+CD25highTreg細(xì)胞與Th17細(xì)胞的比率與SLEDAI呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.527，P＜0.05，圖3）。

圖3 CD4+CD25high/Th17細(xì)胞比率與SLEDAI的相關(guān)性分析

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)Treg與Th17細(xì)胞的比率在初發(fā)的活動(dòng)期SLE患者中下降明顯，并與SLEDAI呈密切相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)Treg和Th17細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例在初發(fā)SLE的異常及與疾病活動(dòng)無相關(guān)性，揭示Treg與Th17細(xì)胞之間的免疫失衡在初發(fā)SLE組發(fā)病中起到一定的作用。

SLE是一種常見的自身免疫性疾病，累及多個(gè)器官導(dǎo)致一系列的臨床表現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制主要是免疫耐受的失衡，機(jī)體產(chǎn)生大量的自身抗體，導(dǎo)致抗原抗體復(fù)合物形成。免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定需要免疫耐受來維持，免疫耐受可分為中樞性和外周性免疫耐受。Treg是一群能夠“主動(dòng)”地抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)，抑制細(xì)胞的活化和細(xì)胞因子的分泌[1]，是維持外周免疫耐受的最重要機(jī)制。1995年，Sakaguchi等[6]首次定義高表達(dá)IL-2受體α鏈（CD25）的CD4+T細(xì)胞為Treg，其在體外通過細(xì)胞間的直接接觸發(fā)揮免疫抑制作用，在體內(nèi)可能還通過細(xì)胞因子發(fā)揮其功能，隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)多箭頭轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是小鼠Treg的標(biāo)記物和功能調(diào)節(jié)基因[7]，然而，在人活化的T細(xì)胞中也能短暫表達(dá)Foxp3[8]，說明其不是人Treg的特異標(biāo)記物，目前仍認(rèn)為CD4+CD25highT細(xì)胞是人較特異的標(biāo)記物[9]，因此本研究選擇此群細(xì)胞來定義Treg。Th17細(xì)胞是一群促炎癥細(xì)胞，能分泌IL-17A、IL-17F及IL-21，導(dǎo)致組織的炎癥反應(yīng)。在體外由TGF-β和IL-6誘導(dǎo)產(chǎn)生Th17細(xì)胞，其中維甲酸孤兒核受體RORγt是Th17細(xì)胞分化的重要因子[2-3]。Treg和Th17細(xì)胞在自身免疫性疾病中的作用越來越受到重視，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，多發(fā)性硬化等。

本研究發(fā)現(xiàn)初發(fā)SLE組Treg占CD4+T細(xì)胞的比例并不降低，與SLEDAI無相關(guān)性。已有大量的研究發(fā)現(xiàn)在活動(dòng)性SLE患者外周血Treg的數(shù)目減少[9-10]，但有少數(shù)研究發(fā)現(xiàn)其比例是正常的[11]，相反的，也有研究發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性SLE患者的Treg是上升的[12]。以上結(jié)果說明Treg在SLE中的作用不盡一致，可能與Treg的標(biāo)記物選擇有關(guān)。接著我們分析初發(fā)SLE患者外周血Th17細(xì)胞的比例，同樣也未發(fā)現(xiàn)有臨床意義。Wong等[14]發(fā)現(xiàn)SLE患者Th17細(xì)胞在活動(dòng)期明顯增加，并與SLEDAI呈正相關(guān)。最近的研究發(fā)現(xiàn)Th17細(xì)胞在SLE中有一定的作用，但是確切機(jī)制尚不明確[15]。

本研究中的重要發(fā)現(xiàn)是初發(fā)的活動(dòng)性SLE患者存在Treg和Th17細(xì)胞的比率明顯下降，與疾病活動(dòng)呈明顯的負(fù)相關(guān)。Yang等[16]也發(fā)現(xiàn)活動(dòng)性SLE患者存在Th17細(xì)胞的擴(kuò)增，且伴隨Treg的下降，我們的前期研究[17]發(fā)現(xiàn)經(jīng)治療后臨床緩解的活動(dòng)性SLE患者的SLEDAI明顯下降，伴隨Treg和Th17細(xì)胞的失衡被逆轉(zhuǎn)。以上結(jié)果表明Treg與Th17細(xì)胞的免疫失衡是初發(fā)活動(dòng)性SLE的臨床特征和參與其發(fā)生和發(fā)展。Treg和Th17細(xì)胞的分化存在相互制約，例如IL-6聯(lián)合TGF-β能誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的分化，而IL-6抑制Treg的體外抑制功能。同樣，IL-2是Treg誘導(dǎo)的必需細(xì)胞因子，也是維持Treg功能的重要因素，相反IL-2能抑制Th17細(xì)胞的分化[21]。因此，我們認(rèn)為初發(fā)SLE患者存在異常的免疫環(huán)境導(dǎo)致Treg和Th17細(xì)胞的失衡。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)初發(fā)活動(dòng)性SLE患者存在Treg與Th17細(xì)胞的比率降低，可輔助作為判斷疾病活動(dòng)的指標(biāo)。兩群細(xì)胞間的免疫失衡參與初發(fā)SLE的發(fā)生和發(fā)展。本研究的結(jié)果提示我們可以通過調(diào)控Treg和Th17細(xì)胞的平衡來治療SLE等自身免疫性疾病。

[1]Sakaguchi S．Naturally arising Foxp3-expressing CD25+CD4+regulatory T cells in immunological tolerance to self and non-self [J]．Nat Immunol,2005,6(4):345-352．

[2]Harrington L E,Hatton R D,Mangan P R,et al．Interleukin 17-producing CD4+effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages[J]．Nat Immunol,2005,6 (11):1123-1132．

[3]Park H,Li X O,Yang S H,et al．A distinct lineage of CD4+T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17[J]．Nat Immunol,2005,6(11):1133-1141．

[4]Bettelli E,Carrier Y,Gao W,et al．Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector Th17 and regulatory T cells[J]．Nature,2006,441(7090):235-238．

[5]Ma J,Yu J,Tao X,et al．The imbalance between regulatory and IL-17-secreting CD4+T cells in lupus patients[J]．Clin Rheumatol, 2010,29(11):1251-1258．

[6]Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,et al．Immunological self-tolerance maintained by activated T cells expression IL-2 receptor α-chains(CD25):breakdown of single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune disease[J]．J Immunol,1995, 155(3):1151-1164．

[7]Fontenot J D,Gavin M A,Rudensky A Y．FOXP3 programs the development and function of CD4+CD25+regulatory T cells[J]．Nat Immunol,2003,4(4):330-336．

[8]Tran D Q,Ramsey H,Shevach E M．Induction of FOXP3 expression in naive human CD4+FOXP3 T cells by T-cell receptor stimulation is transforming growth factor-beta dependent but does not confer a regulatory phenotype[J]．Blood,2007,110(8):2983-2990．

[9]Baecher-Allan C,Brown J A,Freeman G J,et al．CD4+CD25highregulatory cells in human peripheral blood[J]．J Immunol,2001, 167(3):1245-1253．

[10]Valencia X,Yarboro C,Illei G,et al．Deficient CD4+CD25highT regulatory cell function in patients with active systemic lupus erythematosus[J]．J Immunol,2007,178(4):2579-2588．

[11]Mellor-Pita S,Citores M J,Castejon R,et al．Decrease of regulatory T cells in patients with systemic lupus erythematosus[J]．Ann Rheum Dis,2006,65(4):553-554．

[12]Alvarado-Sánchez B,Hernández-Castro B,Portales-Pérez D,et al．Regulatory T cells in patients with systemic lupus erythematosus[J]．J Autoimmun,2006,27(2):110-118．

[13]Bonelli M,von Dalwigk K,Savitskaya A,et al．Foxp3 expression in CD4+T cells of patients with systemic lupus erythematosus (SLE):A comparative phenotypic analysis[J]．Ann Rheum Dis, 2008,67(5):664-671．

[14]Monk C R,Spachidou M,Rovis F,et al．MRL/Mp CD4+CD25-T cells show reduced sensitivity to suppression by CD4+CD25+regulatory T cells in vitro．A novel defect of T Cell regulation in systemic lupus erythematosus[J]．Arthritis Rheum,2005,52(4): 1180-1184．

[15]Wong C K,Lit L C,Tam L S,et al．Hyperproduction of IL-23 and IL-17 in patients with systemic lupus erythematosus:implications for Th17-mediated inflammation in autoimmunity[J]．Clin Immunol,2008,127(3):385-393．

[16]Kang H K,Liu M,Datta S K．Low-dose peptide tolerance therapy of lupus generates plasmacytoid dendritic cells that cause expansion of autoantigen-specific regulatory T cells and contraction of inflammatory Th17 cells[J]．J Immunol,2007,178(12): 7849-7858．

[17]Yang J,Chu Y,Yang X,et al．Th17 and natural Treg cell population dynamics in systemic lupus erythematosus[J]．Arthritis Rheum,2009,60(5):1472-1483．

[18]Ma J,Yu J,Tao X,et al．The imbalance between regulatory and IL-17-secreting CD4+T cells in lupus patients[J]．Clin Rheumatol,2010,29(11):1251-1258．

[19]Tackey E,Lipsky PE,Illei GG．Rationale for interleukin-6blockade in systemic lupus erythematosus[J]．Lupus,2004,13(5):339-343．

[20]Wan S,Xia C,Morel L．IL-6 produced by dendritic cells from lupus-prone mice inhibits CD4+CD25+T cell regulatory functions[J]．J Immunol,2007,178(1):271-279．

[21]Zheng S G,Wang J,Wang P,et al．IL-2 is essential for TGF-β to convert nave CD4+CD25-cells to CD25+Foxp3+regulatory T cells and for expansion of these cells[J]．J Immunol,2007,178 (4):2018-2027．

[22]Laurence A,Tato C M,Davidson T S,et al．Interleukin-2 signaling via STAT5 constrains T helper 17 cell generation[J]．Immunity,2007,26(3):371-381．

[23]Yang J,Yang X,Zou H,et al．Recovery of the immune balance between Th17 and regulatory T cells as a treatment for systemic lupus erythematosus[J]．Rheumatology,2011,50(8):1366-1372．

Clinical significance of regulatory T cells and Th17 cells in the patients with new-onset systemic lupus erythematosus

Objective To determine the ratio of CD25 and IL-17A cells in peripheral CD4+T cells of new-onset patients with systemic lupus erythematosus(SLE)and to assess their clinical significance．Methods Fifteen new-onset patients with systemic lupus erythematosus,including 10 active cases and 5 inactive cases,and 10 healthy individuals were enrolled in the study．The ratio of CD25 and IL-17A cells in peripheral CD4+T cells was analyzed by flow cytometry．Disease activity was assessed by systemic lupus erythematosus activity index(SLEDAI)．Results There was no significant difference in frequency of CD4+CD25highT cells and Th17 cells between SLE patients and normal controls(P＞0．05)．The frequency of CD4+CD25highT cells and Th17 cells was not correlated with SLEDAI scores of patients(P＞0．05)．The ratio of CD4+CD25highT cells and Th17 cells in active SLE patients was significantly lower than that in inactive patients and healthy controls (P＜0．05)and it was negatively correlated with SLEDAI scores(P＜0．05)．Conclusion The results indicate that the imbalance of Treg cells and Th17 cells may be involved in the pathogenesis of SLE．

Lupus erythematosus Systemic Regulatory T cells Th17 cells

2012-08-01）

（本文編輯：楊麗）

國(guó)家自然科學(xué)基金（81274161，81001307），浙江省自然科學(xué)基金（Y2090918）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金計(jì)劃項(xiàng)目（2012RCA046，2011KYA137，2007A162）；杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（20080333Q28，20110733Q15，20110833B26）

310003 杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院風(fēng)濕免疫腎臟科

馬紀(jì)林，E-mail：majilin080808@gmail.com