亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        Gja5基因表達(dá)對小鼠下肢新生動脈生成影響機(jī)制的研究

        2013-04-18 08:38:49王海濤嚴(yán)志焜許林海胡志斌潘曉華
        浙江醫(yī)學(xué) 2013年8期
        關(guān)鍵詞:腓腸肌結(jié)扎術(shù)患肢

        王海濤 嚴(yán)志焜 許林海 胡志斌 潘曉華

        Gja5基因表達(dá)對小鼠下肢新生動脈生成影響機(jī)制的研究

        王海濤 嚴(yán)志焜 許林海 胡志斌 潘曉華

        目的 研究Gja5基因表達(dá)在小鼠下肢新生動脈生成中的保護(hù)作用。方法 將168只Gja5基因敲除小鼠分為CX40基因敲除實驗組(Gja5-/-組),CX40雜合子組(Gja5+/-組)和對照組野生型小鼠(Gja5+/+組)3組,每組56只。另選擇增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的Gja5基因小鼠20只。在熒光顯微鏡下觀察EGFP標(biāo)記的Gja5基因在小鼠動脈的表達(dá),建立小鼠下肢股動脈閉塞模型,應(yīng)用激光多普勒血流儀(LDF)動態(tài)監(jiān)測股動脈結(jié)扎術(shù)前,術(shù)后當(dāng)天及術(shù)后1、3、7、14、21d下肢缺血區(qū)域的血流恢復(fù)情況,同時使用RT-PCR法檢測Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達(dá)。結(jié)果 EGFP標(biāo)記的Gja5基因(CX40基因)表達(dá)在小鼠的腦動脈和股動脈上。在股動脈結(jié)扎術(shù)后1、3、7、14、21d,Gja5-/-組小鼠的患肢血供較Gja5+/+組明顯減少。在股動脈結(jié)扎術(shù)后3d時,Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達(dá)升高了約4倍,術(shù)后7d時逐漸回到基線水平。 結(jié)論 Gja5基因表達(dá)在小鼠下肢新生動脈生成中發(fā)揮了重要的保護(hù)作用。

        Gja5 基因 小鼠 下肢 新生動脈生成

        缺血性心血管疾病是目前發(fā)達(dá)國家及眾多發(fā)展中國家中成人最常見的死因之一[1],所以新生動脈生成和修復(fù)機(jī)制的研究對于缺血性心血管疾病具有重大意義。促進(jìn)代償性血管重建是富有前景的治療新策略[2]??p隙連接(GJ)是含有多種細(xì)胞間通道的特殊膜結(jié)構(gòu),容許離子、小分子代謝產(chǎn)物、第二信使等通過,是調(diào)節(jié)血管功能的一種關(guān)鍵因子[3-4]。GJ參與細(xì)胞間物質(zhì)交換的代謝偶聯(lián)和電信號傳遞的電偶聯(lián),進(jìn)行細(xì)胞間信息傳遞(GJIC),在細(xì)胞的生長、分化、生理功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[5-6]。體內(nèi)研究證實Gja5基因作為組成的跨物種和血管床的縫隙連接蛋白CX40,在血管壁細(xì)胞之間的耦合鏈接中發(fā)揮重要的作用,但Gja5基因縫隙連接蛋白CX40的具體調(diào)控機(jī)制尚不知曉[7]。本研究通過熒光顯微鏡下觀察增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)標(biāo)記的Gja5基因在小鼠動脈的表達(dá),研究其在小鼠下肢新生動脈生成中的保護(hù)作用,現(xiàn)報道如下。

        1 材料和方法

        1.1 實驗動物分組及模型建立

        1.1.1 實驗動物 所有實驗小鼠均來自于德國MDC生物醫(yī)學(xué)中心,清潔級。體重25~35(28.35±0.81)g,雌雄不拘;無人畜共患疾病,共188只。其中Gja5基因敲除小鼠(Gja5基因敲除組)168只,Gja5 EGFP小鼠(CX40 EGFP組)20只。將Gja5基因敲除組小鼠分為3個亞組:CX40基因敲除實驗組(Gja5-/-組),CX40雜合子組(Gja5+/-組)和對照組野生型小鼠(Gja5+/+組),每組56只。1.1.2 建立小鼠下肢股動脈閉塞模型(血流驅(qū)動的新生動脈生成動物模型)(1)麻醉:采用氯胺酮100mg/kg(100mg/ml)和甲苯噻嗪10mg/kg(20mg/ml)行腹腔注射麻醉,麻醉完成后小鼠平臥在操作臺上,局部溫度保持37℃,雙足采用膠布固定,雙眼使用眼藥膏保護(hù)。(2)手術(shù):小鼠右腹股溝手術(shù)區(qū)使用脫毛霜脫毛,70%乙醇消毒。平行股動靜脈方向行皮膚切口0.5cm,確定股神經(jīng),股動脈和股靜脈血管神經(jīng)束。暴露股動脈、股靜脈和股神經(jīng),并小心分離。根據(jù)Hoefer[8]的方法雙重結(jié)扎股動脈。多數(shù)情況下的近端旋股動脈和側(cè)尾鰭股動脈緊密相連。于這兩個分支的近端第1次結(jié)扎,兩個分支遠(yuǎn)端第2次結(jié)扎。在第2次結(jié)扎點遠(yuǎn)端位置,股動脈分為隱動脈和腘動脈,最后縫合手術(shù)切口(圖1)。

        圖1 小鼠手術(shù)示意圖

        1.2 方法

        1.2.1 激光多普勒血流成像技術(shù)(LDF)評估血流灌注情況 采用英國Moor設(shè)備有限公司的MoorLDI2-HR高分辨率成像儀。股動脈被結(jié)扎后,采用非侵入性的LDF動態(tài)監(jiān)測下肢缺血區(qū)域的血流恢復(fù)情況。其中多普勒信號與皮膚上直徑為200~300μm的血管內(nèi)血流灌注量成正比。比較對側(cè)(非結(jié)扎側(cè))的肢體,研究區(qū)域組織灌注的量化,顯示為彩色編碼的圖像。結(jié)合肢體灌注的其他測量措施,從足部獲得相關(guān)的彩色編碼的圖像。小鼠被麻醉后,應(yīng)用LDF動態(tài)監(jiān)測并記錄股動脈結(jié)扎術(shù)前、術(shù)后當(dāng)天及術(shù)后1、3、7、14、21d下肢缺血區(qū)域的血流灌注量。血流灌注量的單位以PU表示。

        1.2.2 Real-time RT-PCR檢測 在股動脈結(jié)扎術(shù)后7d,以頸椎脫臼法處死Gja5+/+組和Gja5+/-組小鼠各8只,從股動脈結(jié)扎側(cè)和非結(jié)扎側(cè)的大腿和下肢剝離皮膚和筋膜,分離和切除腓腸肌,立即冷凍在液氮中并儲存于-80℃冰箱。采用Trizol試劑提取腓腸肌的總RNA?;诘聡鳥ioTez有限責(zé)任公司生產(chǎn)的TaqMan探針,開始進(jìn)行Real-time RT-PCR檢測。并根據(jù)使用說明書,通過TaqMan基因表達(dá)MasterMix序列檢測系統(tǒng)進(jìn)行實時PCR擴(kuò)增反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)被重復(fù)測試3次。甘油磷酸鹽脫氫酶被正?;螅嬎鉳RNA的相對值。采用Primer Express 2.0軟件設(shè)計引物和探針序列。

        1.2.3 Real-time RT-PCR檢測 Gja5小鼠實時RTPCR法(5′to 3)正向引物:CAGCCTGGCTGAACTCTACCA。反向引物:CTGCCGTGACTTGCCAAAG。Taq-Man探針:CGCTGTCGGATCTTCTTCCAGCCCAG。Gja5基因敲除小鼠基因型引物(5′to 3)正向引物:TGGAGCCACAGTTGCAATGGT。反向引物(Gja5-/-組):TCTCTGACTCCGAAAGGCAG。反向引物(Gja5-/-組):GCACGAGACTAGTGAGACGTG。

        1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示。Gja5-/-組和Gja5+/+組的組間比較、Gja5+/-組和Gja5+/+組的組間比較采用t檢驗。

        2 結(jié)果

        2.1 Gja5基因的表達(dá) Gja5基因在小鼠的腦動脈Willis環(huán)上(圖2)和在小鼠的股動脈上(圖3)的表達(dá)。

        圖2 Gja5基因在小鼠的腦動脈Willis環(huán)上的表達(dá)

        圖3 Gja5基因在小鼠的股動脈上的表達(dá)

        2.3 Gja5+/+組、Gja5-/-組及Gja5+/-組 3組間通過LDF成像比較下肢缺血區(qū)域的血流灌注量,結(jié)果見表1。3組術(shù)后3d和7d下肢缺血區(qū)域的血流灌注圖像,見圖4、5。

        由表1可見,在股動脈結(jié)扎術(shù)前,Gja5+/+,Gja5+/-及Gja5-/-3組之間的患肢血供差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05);在股動脈結(jié)扎術(shù)后1、3、7、14、21d,Gja5+/+組與Gja5-/-組比較,小鼠的患肢血供恢復(fù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05),而Gja5+/+組和Gja5+/-組比較,小鼠的患肢血供恢復(fù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。

        2.4 Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達(dá) Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達(dá)顯示為結(jié)扎側(cè)/非結(jié)扎側(cè)的比值。在股動脈結(jié)扎術(shù)后3d,Gja5基因在Gja5+/+和Gja5+/-兩組間腓腸肌的表達(dá)均升高了約4倍(4.015±0.036,4.241±0.125),股動脈結(jié)扎術(shù)后7d,其表達(dá)均逐漸回到基線水平(1.0)。Gja5+/+和Gja5+/-兩組的Gja5基因在小鼠下肢腓腸肌的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

        表1 3組通過LDF成像比較下肢缺血區(qū)域的血流灌注量(PU)

        圖4 股動脈結(jié)扎術(shù)后3d各組LDF灌注圖像

        圖5 股動脈結(jié)扎術(shù)后7d各組LDF灌注圖像

        3 討論

        當(dāng)前冠心病的治療仍依賴各類藥物擴(kuò)張血管,此種方法不能阻斷病程的發(fā)展,最后往往不得不施行血管再通或旁路搭橋手術(shù)。由于再通后的冠狀動脈及移植的旁路血管易再次阻塞且不適于病變廣泛的病例,所以這類手術(shù)的應(yīng)用受到一定的限制。外周血管栓塞性疾病如血栓閉塞性脈管炎由于缺乏有效的治療方法,使很多患者付出了截肢的代價。血管重建包括血管發(fā)生、血管新生及動脈生成,是機(jī)體在血管閉塞狀態(tài)下的病理生理性代償反應(yīng)。以改善缺血為目的,應(yīng)用促血管因子、基因治療和血管祖細(xì)胞補(bǔ)充治療已成為當(dāng)前缺血性血管疾病治療的研究熱點[9-10]。動脈生成是指由于動脈阻塞,血流再分配使側(cè)支微動脈血流量增加、血管內(nèi)剪切力增加,引起細(xì)胞增殖、血管重塑,從而形成大的有功能的側(cè)支動脈的過程,所形成的動脈能夠有效地恢復(fù)動脈阻塞所致缺血區(qū)的血液供應(yīng)[11-15]。側(cè)支動脈生成比血管新生更重要,促進(jìn)側(cè)支動脈生成,恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)及改善組織細(xì)胞的氧和營養(yǎng)物質(zhì)供給,能夠全面的治療缺血性血管疾病,它將成為缺血性血管疾病治療的發(fā)展方向[16]。

        GJ是含有多種細(xì)胞間通道的特殊膜結(jié)構(gòu),每個GJ由來自相鄰細(xì)胞膜上的2個縫隙連接半通道,也稱為連接子組成,每個連接子由6個連接蛋白分子構(gòu)成6聚體蛋白質(zhì),中間包繞水相孔道,形成一個在相鄰細(xì)胞漿可進(jìn)行離子和小分子物質(zhì)交換的孔道和低阻的電沖動通道[17]。GJ在血管發(fā)育和血管功能中發(fā)揮了多方面的作用,也參與了神經(jīng)發(fā)生和血管生成[18]。

        為了證實Gja5基因在新生動脈形成中的調(diào)節(jié)作用,我們使用Gja5基因突變小鼠,并建立血流驅(qū)動的新生動脈形成模型,股動脈閉塞模型[8]。在一個特定的位點結(jié)扎股動脈,從而觸發(fā)了結(jié)扎點近端小的且預(yù)先存在的側(cè)支動脈轉(zhuǎn)化成有功能的新生動脈,以及遠(yuǎn)端的缺血性血管新生。下肢缺血后的血管反應(yīng),可以很容易地被LDF和新生動脈形成的組織學(xué)的指標(biāo)來評估。本研究中,通過熒光顯微鏡觀察EGFP標(biāo)記的Gja5基因在小鼠動脈的表達(dá)。使用Gja5 EGFP小鼠,我們可以發(fā)現(xiàn)Gja5基因表達(dá)在小鼠的腦動脈Willis環(huán)和股動脈上。通過LDF檢測,我們發(fā)現(xiàn)在股動脈結(jié)扎術(shù)后1~21d,Gja5+/+組和Gja5-/-組小鼠的患肢血供恢復(fù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義,而Gja5+/+組和Gja5+/-組小鼠的患肢血供恢復(fù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。從而認(rèn)為Gja5基因在新生動脈生成中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能,可作為動脈標(biāo)記物。在股動脈結(jié)扎術(shù)后3d,Gja5基因在腓腸肌的表達(dá)升高了4倍,股動脈結(jié)扎術(shù)后7d,在缺血后肢,無論是在Gja5+/-小鼠和Gja5+/+小鼠,其表達(dá)水平均逐漸恢復(fù)到基線水平。有趣的是,Pipp等[19]在豬的缺血后肢新生動脈生成模型中發(fā)現(xiàn)非常高的流體切應(yīng)力(FSS)水平和豐富的側(cè)支循環(huán),從而表明了FSS的重要性,通常情況下,在以后各階段的動脈生成中,隨著新生動脈的直徑增大,F(xiàn)SS逐漸下降至正常水平,可防止新生動脈直徑進(jìn)一步增長,從而達(dá)到最佳適應(yīng)。Pipp等[19]發(fā)現(xiàn),在他們的動靜脈分流模型中,進(jìn)一步持續(xù)升高FSS,可顯著增加新生動脈的直徑大小,由此,我們可以發(fā)現(xiàn),Gja5基因表達(dá)在股動脈閉塞模型上的變化趨勢與FSS在動脈生成上的變化趨勢是相同的,從而確立了FSS是新生動脈生成的激發(fā)因素。因此,我們認(rèn)為,Gja5在新生動脈生成中發(fā)揮了重要的職能作用,但需要進(jìn)一步的研究股動脈閉塞后Gja5表達(dá)和FSS變化之間的關(guān)系。另外Gja5表達(dá)在動脈內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)可能影響到患肢灌注減少。因此,要研究這個功能的參與,我們也需要進(jìn)一步研究在小鼠動脈內(nèi)皮細(xì)胞特異性的基因敲除Gja5基因的表達(dá)。Gja5在新生動脈生成中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能,可作為動脈標(biāo)記物。

        [1]Hamawy A H,Lee L Y,Crystal R G,et al.Cardiac angiogenesis and gene therapy:a strategy for myocardial revascularization[J].Curr Opin Cardio1,1999,14(6):515-522.

        [2]Prior B M,Yang H T,Terjung R L,et al.What makes vessels grow with exercise training[J]?J Appl Physiol,2004,97(3):1119-1128.

        [3]Haefliger J A,Nicod P,Meda P.Contribution of connexins to the function of the vascular wall[J].Cardiovasc Res,2004,62(2):345-356.

        [4]Ross R.Cell biology of atherosclerosis[J].Annu Rev Physiol,1995, 57:791-804.

        [5]Lodish H F,Rodriguez R K,Klionsky D J.Points of view:lectures: can't learn with them,can't learn without them[J].Cell Biol Educ, 2004,3(4):202-211.

        [6]Sohl G K.Willecke.Gap junctions and the connexin protein family[J].Cardiovasc Res,2004,62(2):228-232.

        [7]Miquerol L,Meysen S,Mangoni M,et al.Architectural and functional asymmetry of the His-Purkinje system of the murine heart [J].Cardiovasc Res,2004,63(1):77-86.

        [8]Hoefer I E,van Royen N,Rectenwald J E,et al.Arteriogenesis proceedsvia ICAM-1/Mac-1-mediatedmechanisms[J].Circ Res, 2004,94(9):1179-1185.

        [9]Carmeliet P.Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis[J].Nat Med,2000,6(4):389-395.

        [10]Adams R H,Alitalo.Molecular regulation of angiogenesis and lymphangiogenesis[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(6):464-478.

        [11]Van Oostrom M C,van Oostrom O,Quax P H,et al.Insights into mechanisms behind arteriogenesis:what does the future hold [J]?J Leukoc Biol,2008,84(6):1379-1391.

        [12]Buschmann I,Schaper W.The pathophysiology of the collareral circulation(arteriogenesis)[J].J Patho1,2000,190(3):338-342.

        [13]Schaper W.Collateral circulation:past and present[J].Basic Res Cardiol,2009,104(1):5-21.

        [14]Heil M,Schaper W.Influence of mechanical,cellular,and molecular factors on collateral artery growth(arteriogenesis)[J].Circ Res,2004,95(5):449-458.

        [15]Heil M,Eitenmuller I,Schmitz-Rixen T,et al.Arteriogenesis versus angiogenesis:similarities and differences[J].J Cell Mol Med, 2006,10(1):45-55.

        [16]Buschmann I,Schaper W.Arteriogenesis Versus Angiogenesis: Two Mechanisms of Vessel Growth[J].News Physiol Sci,1999,14: 121-125.

        [17]Kwak B R,Pepper M S,Gros D B,et al.Inhibition of endothelial wound repair by dominant negative connexin inhibitors[J].Mol Biol Cell,2001,12(4):831-845.

        [18]Carmeliet P,Tessier-Lavigne M.Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring[J].Nature,2005,436(7048):193-200.

        [19]Pipp F,Boehm S,Cai W J,et al.Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hindlimb[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2004,24(9):1664-1668.

        Relationship between Gja5 gene expression and arteriogenesis in mouse hindlimb

        Objective To investigate the relationship between the gene expression of Gja5(connexin-40,CX-40)and arteriogenesis on the hindlimb in mice.Methods One hundred and sixty eight mice were used in the study,including 56 CX40 knockout mice(Gja5-/-group),56 CX40 heterozygous mice(Gja5+/-group)and 56 wild-type mice(Gja5+/+group).The hindlimb blood flow blockage was induced by femoral arteries occlusion(FAO).The scanning Laser Doppler Flow Imager was used to observe the expression of Gja5 in Gja5 EGFP reporter animals through fluorescent microscope.Gja5 gene expression was also detected in gastrocnemicus(GC)muscle by real-time RT-PCR before and 1,3,7,14,21d after FAO.Results The Gja5 gene was expressed in mouse arteries including cerebral artery and femoral artery.There were significant reductions for hindlimb perfusion in Gja5-/-mice compared to Gja5+/+mice at d1,3,7,14 and 21 after FAO.The expression levels of Gja5 in Gja5+/-mice and Gja5+/+mice in GC muscle were both increased 4-fold in the ischemic hindlimb at d3 after FAO.Then the expression levels of Gja5 returned to baseline values at d7 after FAO.Conclusion Arterial Gja5 expression may be involved in the arteriogenesis of ischemic hindlimb of mice.

        Gja5 Gene Mice Hindlimb Arteriogenesis

        2012-08-23)

        (本文編輯:楊麗)

        浙江省錢江人才計劃D類項目(QJD1202017),浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生平臺重點資助計劃項目(2013ZDA003)

        310014 杭州,浙江省人民醫(yī)院心胸外科

        王海濤,E-mail:wanght1974@hotmail.com

        猜你喜歡
        腓腸肌結(jié)扎術(shù)患肢
        高頻超聲評估2型糖尿病患者腓腸肌病變的診斷價值
        股骨髁間骨折術(shù)后患肢采用特殊體位制動加速康復(fù)的效果觀察
        腹腔鏡下鞘狀突高位結(jié)扎術(shù)治療小兒鞘膜積液
        一種水墊式患肢抬高枕的設(shè)計及應(yīng)用
        雙側(cè)子宮動脈上行支結(jié)扎術(shù)聯(lián)合改良B-Lynch縫合術(shù)治療難治性產(chǎn)后出血效果觀察
        石氏三色膏治療小腿腓腸肌損傷60例
        中成藥(2018年10期)2018-10-26 03:41:40
        團(tuán)隊互助模式對乳腺癌患者術(shù)后患肢功能鍛煉依從性的影響
        輸精管結(jié)扎術(shù)后中遠(yuǎn)期對附睪、睪丸影響的超聲觀察
        腓腸肌損傷的MRI臨床診斷研究
        磁共振成像(2015年5期)2015-12-23 08:52:53
        中西醫(yī)結(jié)合治療脛腓骨雙骨折術(shù)后并發(fā)患肢水腫的效果分析
        国产麻豆一区二区三区在| 国产成人一区二区三中文| 国产一精品一aⅴ一免费| 按摩偷拍一区二区三区| 人妻夜夜爽天天爽三区丁香花| 亚洲国产成人无码av在线影院| 热99精品| av免费看网站在线观看| 国产精品一区二区黄色| 国产成人无码av一区二区| 亚洲男人天堂网站| 国产av一区二区三区国产福利| 男女边摸边吃奶边做视频韩国| 精品人妻中文无码av在线| 夜夜综合网| 久久综合老鸭窝色综合久久| 亚洲成av人片在线观看| 黄色a级国产免费大片| 日本在线观看不卡| 白色白在线观看免费2| 男女性爽大片视频| 久久久久99精品国产片| 蜜桃视频色版在线观看| 成人一区二区人妻少妇| 亚洲国产天堂一区二区三区| 欧美日韩亚洲成色二本道三区 | 国内精品少妇高潮视频| 97久久精品无码一区二区天美| 综合无码一区二区三区四区五区| 日本成年少妇人妻中文字幕| 男人国产av天堂www麻豆| 日本高清www无色夜在线视频| WWW拍拍拍| 亚洲sm另类一区二区三区| 狠狠色婷婷久久综合频道日韩| 久久精品国产亚洲AⅤ无码| 精品中文字幕久久久人妻 | 欧美中日韩免费观看网站| 狠狠躁天天躁无码中文字幕图| 国内精品少妇久久精品| 五月丁香六月综合缴清无码 |