張新民 陳鵬 張素勤 吳連拼 李岳春

泛素蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)CVB3病毒性心肌炎小鼠的作用研究

張新民 陳鵬 張素勤 吳連拼 李岳春

目的 通過(guò)抑制CVB3病毒性心肌炎小鼠中泛素蛋白酶體途徑，研究泛素蛋白酶體系統(tǒng)在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用機(jī)制。方法 將72只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為心肌炎組（CVB組）、心肌炎+泛素蛋白酶體抑制劑MG-132處理組（CVB+T組）、正常對(duì)照組（Sham組）、正常對(duì)照+處理組（Sham+T組），每組各18只。前兩組腹腔接種CVB3病毒誘發(fā)急性心肌炎，后兩組腹腔注射PBS，CVB+T組和Sham+T組次日腹腔注射MG-132，0.75 mg/kg，連續(xù)給藥7d。第8天取材，觀察小鼠心肌組織病理變化，測(cè)定心肌CVB3病毒復(fù)制及血清肌鈣蛋白I（cTnI）、腦鈉肽（BNP）水平。 結(jié)果 心肌病理檢查顯示，Sham組與Sham+T組未見(jiàn)異常變化，CVB+T組心肌炎癥性浸潤(rùn)和變性壞死較CVB組顯著減輕；心臟重量/身體重量比值CVB組為6.18± 0.40、CVB+T組為5.32±0.38，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。cTnI、BNP水平CVB組為（3.88±0.08）μg/L、（3 002±256）pg/ml，CVB+T組為（1.52±0.05）μg/L、（1 506±142）pg/ml，CVB+T組均降低（均P＜0.05）；熒光定量PCR顯示CVB3 mRNA水平CVB組（1.42±0.06）高于CVB+T組（0.72±0.04）（P＜0.05）。 結(jié)論 抑制泛素蛋白酶體途徑減少了CVB3病毒復(fù)制，顯著減輕心肌炎小鼠心臟病理?yè)p傷，起到保護(hù)心肌的作用。

泛素蛋白酶體系統(tǒng) 小鼠 心肌炎

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin-proteasome system，UPS）不僅是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑，是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)，而且參與細(xì)胞凋亡、抗原遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過(guò)程，對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義[1]?？滤_奇B3病毒（CVB3）是病毒性心肌炎最重要的致病病毒，在急性期導(dǎo)致心肌炎癥、壞死，并發(fā)心力衰竭及心律失常，可導(dǎo)致猝死及擴(kuò)張性心肌病的發(fā)生。但目前病毒性心肌炎尚無(wú)特殊有效的治療方法[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)UPS在各種病毒感染性疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3-5]，本文旨在研究UPS是否在CVB病毒性心肌炎發(fā)病過(guò)程中起了重要作用，并探討其中的作用機(jī)制。

1 對(duì)象和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及試劑 4周齡雄性近交系SPF級(jí)BALB/ c小鼠，體重（17±2）g，購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。CVB3病毒，滴度為107 TCID50/0.1ml。泛素蛋白酶體抑制劑MG-132為美國(guó)Calbiochem公司生產(chǎn)，0.75mg/kg，用3ml 0.2%的DMSO稀釋。使用的小鼠血清腦鈉肽（BNP）與肌鈣蛋白I（cTnI）ELISA試劑盒為深圳晶美生物工程有限公司提供，熒光定量PCR引物及試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司。

1.2 方法

1.2.1 分組方法 采用雙盲法隨機(jī)將72只小鼠分為4組：心肌炎組（CVB組），心肌炎+MG-132處理組（CVB+T組），正常對(duì)照組（Sham組），正常對(duì)照+MG-132處理組（Sham+T組），每組各18只。

1.2.2 藥物處理和標(biāo)本采集 前兩組經(jīng)腹腔注射100 TCID50/0.1 ml的CVB3稀釋液0.1 ml，后兩組腹腔注射等量0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）。CVB+T組和Sham+T組于接種病毒及膠腔注射PBS次日腹腔注射MG-132，0.75 mg/kg，連續(xù)給藥7 d。第8天時(shí),眼球后靜脈叢取血，在心臟停跳前取心臟標(biāo)本，將心臟沿左心室中線切為兩半，一半用10%甲醛固定待做病理組織學(xué)檢查，一半作real-time PCR檢查。

1.2.3 病理組織學(xué)檢查 將10%甲醛固定的小鼠心臟常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察心肌病理變化，其病變程度由2人分別判斷取平均值，判斷標(biāo)準(zhǔn)為：炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌壞死占每張心臟切片＜25%（+）計(jì)1分，25%~50%（++）計(jì)2分，51%~75%（+++）計(jì)3分，＞75%計(jì)4分。

1.2.4 CVB3 mRNA表達(dá)檢測(cè) Trizol法提取小鼠心肌組織總RNA。引物由大連寶生物公司合成，各引物序列見(jiàn)表1。反轉(zhuǎn)錄cDNA及熒光定量PCR反應(yīng)按大連寶生物公司試劑盒說(shuō)明步驟完成，測(cè)得各基因的Ct值。根據(jù)2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析，公式如下：F=2^-（待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組管家基因平均Ct值）-（所有組目的基因平均Ct值-所有組管家基因平均Ct值）。

表1 CVB3和β-actin的引物序列

1.2.5 BNP和cTnI含量測(cè)定 取小鼠血清，按小鼠BNP和cTnI ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟完成加樣后，把酶標(biāo)板置于450nm的酶標(biāo)儀上，讀取各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與其相對(duì)應(yīng)的OD（X）作出標(biāo)準(zhǔn)曲線及曲線方程，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出各樣品的BNP或cTnI（Y）的量。

1.3 觀察指標(biāo) 觀察各組小鼠心肌病理組織學(xué)變化，心臟重量/身體重量（HW/BW），BNP、cTnI及心肌組織CVB3 mRNA的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以 表示，組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠心肌組織病理變化 CVB組可見(jiàn)明顯的炎癥性浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞變性壞死，Sham組與Sham+T組未見(jiàn)異常變化，而CVB+T組小鼠炎癥性浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞變性壞死較CVB組減輕（圖1，見(jiàn)插頁(yè)）。

2.2各組小鼠心肌病理組織學(xué)評(píng)分及HW/BW比值比較 見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠心肌病理組織學(xué)評(píng)分及HW/BW比值比較

由表2可見(jiàn)，組織炎癥評(píng)分CVB+T組較CVB組減低（P＜0.01或0.05），兩組均較Sham組及Sham+T組高（P＜0.01）。CVB+T組HW/BW比值低于CVB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 各組BNP、cTnI及CVB3 mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表3、圖2。

表3 各組小鼠BNP、cTnI及CVB 3mRNA的表達(dá)水平比較

圖2 CVB3 mRNA熒光定量PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（1：Sham組；2：CVB組；3：CVB+T組；4：Sham+T組；M：DL2000Marker）

由表3、圖2可見(jiàn)，與CVB組相比，CVB+T組BNP、cTnI水平較CVB組下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），CVB組及CVB+T組的BNP和cTnI水平均較Sham組及Sham+T組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。CVB組CVB3 mRNA表達(dá)水平高于Sham組、Sham+T組及CVB+T組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.01）。

3 討論

病毒性心肌炎目前尚無(wú)特殊有效的治療方法，一些免疫治療在隨機(jī)臨床試驗(yàn)中對(duì)急性病毒性心肌炎患者多無(wú)療效，至今沒(méi)有找到一種特異性抗病毒的治療措施[2]。從其他途徑尋找對(duì)策，已成了國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。

UPS在各種病毒感染性疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，各種病毒能利用和操控宿主細(xì)胞的基礎(chǔ)新陳代謝為自身所用[6]，因而UPS能在病毒復(fù)制周期和病毒宿主相互作用中起重要的作用。最近，國(guó)外研究UPS在病毒性心肌炎中的作用已有零星報(bào)道，但目前其機(jī)制還不清楚[3,7]。Gao等[7]研究顯示：泛素蛋白酶體抑制劑MLN353能減輕CVB3誘導(dǎo)的心肌炎癥和超微結(jié)構(gòu)變化。Luo等[3]研究顯示，UPS是病毒性心肌炎心功能逐漸惡化的重要參與途徑。而Raaben等[8]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎與上述研究結(jié)果不一致，他們發(fā)現(xiàn)泛素蛋白酶體抑制劑Velcade能增強(qiáng)冠狀病毒損傷作用。

本實(shí)驗(yàn)在CVB3病毒性心肌炎小鼠模型上給予前期研究使用劑量的蛋白酶體抑制劑（0.75mg/kg），并連續(xù)使用7d，結(jié)果顯示：泛素蛋白酶體抑制劑MG-132能顯著減輕心肌炎小鼠心臟病理?yè)p傷，降低HW/BW比值，MG-132干預(yù)后第8天小鼠BNP、cTnI顯著降低，提示心肌炎癥損傷及壞死明顯減少，心功能改善。同時(shí)熒光定量PCR顯示CVB3 mRNA復(fù)制水平顯著降低，提示MG-132減輕心肌損傷的作用可能是通過(guò)抑制CVB3病毒復(fù)制實(shí)現(xiàn)的。

UPS是機(jī)體內(nèi)重要的功能系統(tǒng)，隨著近年來(lái)對(duì)UPS研究的不斷深入，它在機(jī)體內(nèi)的關(guān)鍵作用逐漸被發(fā)現(xiàn)[9]。本研究利用在體CVB3病毒性心肌炎小鼠模型，發(fā)現(xiàn)UPS在病毒性心肌炎中發(fā)病過(guò)程中起了重要的作用。泛素蛋白酶體抑制劑可能為急性病毒性心肌炎的一種新的治療方法，但仍需更加深入地研究。

[1] Li Y F,Wang X.The role of the proteasome in heart disease[J]. Biochim Biophys Acta,2011,1809:141-149.

[2] Yajima T.Viral myocarditis:potential defense mechanisms within the cardiomyocyte against virus infection[J].Future Microbiol, 2011,6(5):551-566.

[3] Luo H,Wong J,Wong B,et al.Protein degradation systems in viral myocarditis leading to dilated cardiomyopathy[J].Cardiovasc Res,2010,85:347-356.

[4] Contin R,Arnoldi F,Mano M,et al.Rotavirus replication requires a functional proteasome for effective assembly of viroplasms[J]. J.Virol,2011,85:2781-2792.

[5] Raaben M,Posthuma C C,Verheije M H,et al.The Ubiquitin-ProteasomeSystem playsan important role during various stages of the coronavirus infection cycle[J].J Virol,2010,84:7869-7879.

[6] Esfandiarei M,McManus B M.Molecular biology and pathogenesis of viral myocarditis[J].Annu Rev Pathol,2008,3:127-155.

[7] Gao G,Zhang J C,Si XN,et al.Proteasome inhibition attenuates coxsackievirus-induced myocardial damage in mice[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2008,295(1):H401-H408.

[8] Raaben M,Grinwis G C,Rottier P J,et al.The proteasome inhibitor Velcade enhances rather than reduces disease in mouse hepatitis coronavirus-infected mice[J].J Virol,2010,84(15):7880-7885.

[9] Depre C,Powell S R,Wang X.The role of the ubiquitin-proteasome pathwayin cardiovasculardisease[J].Cardiovasc Res,2010, 85(2):251-252.

Effect of ubiquitin-proteasome system on acute viral myocarditis in mice

ZHANG Xinmin,CHEN Peng,ZHANG Suqin,et al.Depart-

ment of Cardiology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,China

【 Abstract】Objective To investigate the effect of ubiquitin-proteasome system on acute viral myocarditis induced by coxsackievirus B3 (CVB3)in mice. Methods BALB/C mice were intraperitoneally inoculated with CVB3 to induce myocarditis. From 24 h after infection,MG-132 was administered at a dose of 0.75 mg/kg for 7d continuously by intraperitoneal injection.Normal controls were treated with same volume of PBS.Then,the myocardial histopathological changes,heart weight/body weight ratio(HW/BW),expression of myocardial CVB3 mRNA and serum cTnⅠand BNP levels were determined.Results Proteasome inhibitor MG-132 significantly attenuated myocardial lesions.HW/BW ratio was 6.18±0.40 in CVB group and 5.32±0.38 in MG-132 treatment group(CVB+T),respectively(P＜0.05).The levels of serum cTnⅠand BNP were 1.52±0.05μg/L and 1 506± 142pg/ml in CVB+T group,which were significantly lower than those in control group (P＜0.05).MG-132 also remarkably down-regulated CVB3 mRNA expression compared with CVB group(0.72±0.04 vs 1.42±0.06,P＜0.05).Conclusion MG-132 protects mice from viral myocarditis induced by CVB3,which is associated with down-regulation of CVB3 mRNA expression.

Ubiquitin-proteasome system Mice Viralmyocarditis

2012-06-01）

（本文編輯：馬雯娜）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81200165）

325027 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科通信作者：李岳春，E-mail：liyuechun2560@sina.com