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        泛素蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)CVB3病毒性心肌炎小鼠的作用研究

        2013-04-18 05:40:18張新民陳鵬張素勤吳連拼李岳春
        浙江醫(yī)學(xué) 2013年5期
        關(guān)鍵詞:蛋白酶體泛素心肌炎

        張新民 陳鵬 張素勤 吳連拼 李岳春

        泛素蛋白酶體系統(tǒng)對(duì)CVB3病毒性心肌炎小鼠的作用研究

        張新民 陳鵬 張素勤 吳連拼 李岳春

        目的 通過抑制CVB3病毒性心肌炎小鼠中泛素蛋白酶體途徑,研究泛素蛋白酶體系統(tǒng)在病毒性心肌炎發(fā)病中的作用機(jī)制。方法 將72只雄性BALB/c小鼠隨機(jī)分為心肌炎組(CVB組)、心肌炎+泛素蛋白酶體抑制劑MG-132處理組(CVB+T組)、正常對(duì)照組(Sham組)、正常對(duì)照+處理組(Sham+T組),每組各18只。前兩組腹腔接種CVB3病毒誘發(fā)急性心肌炎,后兩組腹腔注射PBS,CVB+T組和Sham+T組次日腹腔注射MG-132,0.75 mg/kg,連續(xù)給藥7d。第8天取材,觀察小鼠心肌組織病理變化,測(cè)定心肌CVB3病毒復(fù)制及血清肌鈣蛋白I(cTnI)、腦鈉肽(BNP)水平。 結(jié)果 心肌病理檢查顯示,Sham組與Sham+T組未見異常變化,CVB+T組心肌炎癥性浸潤(rùn)和變性壞死較CVB組顯著減輕;心臟重量/身體重量比值CVB組為6.18± 0.40、CVB+T組為5.32±0.38,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。cTnI、BNP水平CVB組為(3.88±0.08)μg/L、(3 002±256)pg/ml,CVB+T組為(1.52±0.05)μg/L、(1 506±142)pg/ml,CVB+T組均降低(均P<0.05);熒光定量PCR顯示CVB3 mRNA水平CVB組(1.42±0.06)高于CVB+T組(0.72±0.04)(P<0.05)。 結(jié)論 抑制泛素蛋白酶體途徑減少了CVB3病毒復(fù)制,顯著減輕心肌炎小鼠心臟病理?yè)p傷,起到保護(hù)心肌的作用。

        泛素蛋白酶體系統(tǒng) 小鼠 心肌炎

        泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system,UPS)不僅是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑,是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng),而且參與細(xì)胞凋亡、抗原遞呈、細(xì)胞周期以及細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種生理過程,對(duì)維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義[1]??滤_奇B3病毒(CVB3)是病毒性心肌炎最重要的致病病毒,在急性期導(dǎo)致心肌炎癥、壞死,并發(fā)心力衰竭及心律失常,可導(dǎo)致猝死及擴(kuò)張性心肌病的發(fā)生。但目前病毒性心肌炎尚無(wú)特殊有效的治療方法[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)UPS在各種病毒感染性疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[3-5],本文旨在研究UPS是否在CVB病毒性心肌炎發(fā)病過程中起了重要作用,并探討其中的作用機(jī)制。

        1 對(duì)象和方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及試劑 4周齡雄性近交系SPF級(jí)BALB/ c小鼠,體重(17±2)g,購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。CVB3病毒,滴度為107 TCID50/0.1ml。泛素蛋白酶體抑制劑MG-132為美國(guó)Calbiochem公司生產(chǎn),0.75mg/kg,用3ml 0.2%的DMSO稀釋。使用的小鼠血清腦鈉肽(BNP)與肌鈣蛋白I(cTnI)ELISA試劑盒為深圳晶美生物工程有限公司提供,熒光定量PCR引物及試劑盒購(gòu)于大連寶生物公司。

        1.2 方法

        1.2.1 分組方法 采用雙盲法隨機(jī)將72只小鼠分為4組:心肌炎組(CVB組),心肌炎+MG-132處理組(CVB+T組),正常對(duì)照組(Sham組),正常對(duì)照+MG-132處理組(Sham+T組),每組各18只。

        1.2.2 藥物處理和標(biāo)本采集 前兩組經(jīng)腹腔注射100 TCID50/0.1 ml的CVB3稀釋液0.1 ml,后兩組腹腔注射等量0.1 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)。CVB+T組和Sham+T組于接種病毒及膠腔注射PBS次日腹腔注射MG-132,0.75 mg/kg,連續(xù)給藥7 d。第8天時(shí),眼球后靜脈叢取血,在心臟停跳前取心臟標(biāo)本,將心臟沿左心室中線切為兩半,一半用10%甲醛固定待做病理組織學(xué)檢查,一半作real-time PCR檢查。

        1.2.3 病理組織學(xué)檢查 將10%甲醛固定的小鼠心臟常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察心肌病理變化,其病變程度由2人分別判斷取平均值,判斷標(biāo)準(zhǔn)為:炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),心肌壞死占每張心臟切片<25%(+)計(jì)1分,25%~50%(++)計(jì)2分,51%~75%(+++)計(jì)3分,>75%計(jì)4分。

        1.2.4 CVB3 mRNA表達(dá)檢測(cè) Trizol法提取小鼠心肌組織總RNA。引物由大連寶生物公司合成,各引物序列見表1。反轉(zhuǎn)錄cDNA及熒光定量PCR反應(yīng)按大連寶生物公司試劑盒說明步驟完成,測(cè)得各基因的Ct值。根據(jù)2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量分析,公式如下:F=2^-(待測(cè)組目的基因平均Ct值-待測(cè)組管家基因平均Ct值)-(所有組目的基因平均Ct值-所有組管家基因平均Ct值)。

        表1 CVB3和β-actin的引物序列

        1.2.5 BNP和cTnI含量測(cè)定 取小鼠血清,按小鼠BNP和cTnI ELISA試劑盒說明書步驟完成加樣后,把酶標(biāo)板置于450nm的酶標(biāo)儀上,讀取各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品與其相對(duì)應(yīng)的OD(X)作出標(biāo)準(zhǔn)曲線及曲線方程,再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程算出各樣品的BNP或cTnI(Y)的量。

        1.3 觀察指標(biāo) 觀察各組小鼠心肌病理組織學(xué)變化,心臟重量/身體重量(HW/BW),BNP、cTnI及心肌組織CVB3 mRNA的表達(dá)水平。

        1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以 表示,組間比較采用方差分析和t檢驗(yàn)。

        2 結(jié)果

        2.1 各組小鼠心肌組織病理變化 CVB組可見明顯的炎癥性浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞變性壞死,Sham組與Sham+T組未見異常變化,而CVB+T組小鼠炎癥性浸潤(rùn)、心肌細(xì)胞變性壞死較CVB組減輕(圖1,見插頁(yè))。

        2.2各組小鼠心肌病理組織學(xué)評(píng)分及HW/BW比值比較 見表2。

        表2 各組小鼠心肌病理組織學(xué)評(píng)分及HW/BW比值比較

        由表2可見,組織炎癥評(píng)分CVB+T組較CVB組減低(P<0.01或0.05),兩組均較Sham組及Sham+T組高(P<0.01)。CVB+T組HW/BW比值低于CVB組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

        2.3 各組BNP、cTnI及CVB3 mRNA表達(dá)水平比較 見表3、圖2。

        表3 各組小鼠BNP、cTnI及CVB 3mRNA的表達(dá)水平比較

        圖2 CVB3 mRNA熒光定量PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果(1:Sham組;2:CVB組;3:CVB+T組;4:Sham+T組;M:DL2000Marker)

        由表3、圖2可見,與CVB組相比,CVB+T組BNP、cTnI水平較CVB組下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),CVB組及CVB+T組的BNP和cTnI水平均較Sham組及Sham+T組升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。CVB組CVB3 mRNA表達(dá)水平高于Sham組、Sham+T組及CVB+T組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

        3 討論

        病毒性心肌炎目前尚無(wú)特殊有效的治療方法,一些免疫治療在隨機(jī)臨床試驗(yàn)中對(duì)急性病毒性心肌炎患者多無(wú)療效,至今沒有找到一種特異性抗病毒的治療措施[2]。從其他途徑尋找對(duì)策,已成了國(guó)內(nèi)外研究的重點(diǎn)。

        UPS在各種病毒感染性疾病中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用,各種病毒能利用和操控宿主細(xì)胞的基礎(chǔ)新陳代謝為自身所用[6],因而UPS能在病毒復(fù)制周期和病毒宿主相互作用中起重要的作用。最近,國(guó)外研究UPS在病毒性心肌炎中的作用已有零星報(bào)道,但目前其機(jī)制還不清楚[3,7]。Gao等[7]研究顯示:泛素蛋白酶體抑制劑MLN353能減輕CVB3誘導(dǎo)的心肌炎癥和超微結(jié)構(gòu)變化。Luo等[3]研究顯示,UPS是病毒性心肌炎心功能逐漸惡化的重要參與途徑。而Raaben等[8]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎與上述研究結(jié)果不一致,他們發(fā)現(xiàn)泛素蛋白酶體抑制劑Velcade能增強(qiáng)冠狀病毒損傷作用。

        本實(shí)驗(yàn)在CVB3病毒性心肌炎小鼠模型上給予前期研究使用劑量的蛋白酶體抑制劑(0.75mg/kg),并連續(xù)使用7d,結(jié)果顯示:泛素蛋白酶體抑制劑MG-132能顯著減輕心肌炎小鼠心臟病理?yè)p傷,降低HW/BW比值,MG-132干預(yù)后第8天小鼠BNP、cTnI顯著降低,提示心肌炎癥損傷及壞死明顯減少,心功能改善。同時(shí)熒光定量PCR顯示CVB3 mRNA復(fù)制水平顯著降低,提示MG-132減輕心肌損傷的作用可能是通過抑制CVB3病毒復(fù)制實(shí)現(xiàn)的。

        UPS是機(jī)體內(nèi)重要的功能系統(tǒng),隨著近年來(lái)對(duì)UPS研究的不斷深入,它在機(jī)體內(nèi)的關(guān)鍵作用逐漸被發(fā)現(xiàn)[9]。本研究利用在體CVB3病毒性心肌炎小鼠模型,發(fā)現(xiàn)UPS在病毒性心肌炎中發(fā)病過程中起了重要的作用。泛素蛋白酶體抑制劑可能為急性病毒性心肌炎的一種新的治療方法,但仍需更加深入地研究。

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        Effect of ubiquitin-proteasome system on acute viral myocarditis in mice

        ZHANG Xinmin,CHEN Peng,ZHANG Suqin,et al.Depart-

        ment of Cardiology,the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325000,China

        【 Abstract】Objective To investigate the effect of ubiquitin-proteasome system on acute viral myocarditis induced by coxsackievirus B3 (CVB3)in mice. Methods BALB/C mice were intraperitoneally inoculated with CVB3 to induce myocarditis. From 24 h after infection,MG-132 was administered at a dose of 0.75 mg/kg for 7d continuously by intraperitoneal injection.Normal controls were treated with same volume of PBS.Then,the myocardial histopathological changes,heart weight/body weight ratio(HW/BW),expression of myocardial CVB3 mRNA and serum cTnⅠand BNP levels were determined.Results Proteasome inhibitor MG-132 significantly attenuated myocardial lesions.HW/BW ratio was 6.18±0.40 in CVB group and 5.32±0.38 in MG-132 treatment group(CVB+T),respectively(P<0.05).The levels of serum cTnⅠand BNP were 1.52±0.05μg/L and 1 506± 142pg/ml in CVB+T group,which were significantly lower than those in control group (P<0.05).MG-132 also remarkably down-regulated CVB3 mRNA expression compared with CVB group(0.72±0.04 vs 1.42±0.06,P<0.05).Conclusion MG-132 protects mice from viral myocarditis induced by CVB3,which is associated with down-regulation of CVB3 mRNA expression.

        Ubiquitin-proteasome system Mice Viralmyocarditis

        2012-06-01)

        (本文編輯:馬雯娜)

        國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81200165)

        325027 溫州醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科通信作者:李岳春,E-mail:liyuechun2560@sina.com

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