邵蘭 趙琦峰 李豐 吳婷婷 陳其

大鼠缺血再灌注損傷對心肌超微結(jié)構(gòu)的影響及LXA4的保護作用

邵蘭 趙琦峰 李豐 吳婷婷 陳其

目的 探討脂氧素A4（LXA4）對大鼠心肌缺血再灌注損傷（MIRI）超微結(jié)構(gòu)的保護作用。 方法 72只SD雄性大鼠隨機分成假手術(shù)一組（C1組）、假手術(shù)二組（C2組）、MIRI一組（I/R1組）、MIRI二組（I/R2組）、MIRI前用藥組（LX1組）、MIRI后用藥組（LX2組），每組12只。建立大鼠MIRI模型，各組于開胸前取血（T1）、實驗結(jié)束后取血（T2）測IL-1β、IL-8、cTnI血清濃度；同時測定SOD活性、MDA含量；TUNEL法檢測心肌細(xì)胞凋亡率；電鏡下觀察心肌超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果 I/R1、LX1與C1組相比，I/R2、LX2與C2組相比，血清IL-1β、IL-8、cTnI濃度（均為T2），SOD、MDA以及凋亡率增高（P＜0.05）。LX1與I/R1組，LX2與I/R2組相比，血清IL-1β、IL-8、cTnI濃度（均為T2），MDA含量及凋亡率均降低（均P＜0.05）；SOD活性提高（P＜0.05）；同時心肌超微結(jié)構(gòu)損傷明顯改善，線粒體排列整齊，電子密度增高，腫脹及空泡明顯減輕。結(jié)論 LXA4通過抑制組織促炎細(xì)胞因子、氧自由基損傷，降低細(xì)胞凋亡來減輕心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，對大鼠MIRI起明顯的保護作用。

心肌缺血再灌注損傷 脂氧素 氧化應(yīng)激 凋亡 超微結(jié)構(gòu)

心肌缺血再灌注損傷（MIRI）是目前影響心血管外 科手術(shù)療效的主要難題之一。MIRI的發(fā)生機制較為復(fù)雜，其中中性粒細(xì)胞活化、細(xì)胞因子和氧自由基作用等是參與MIRI發(fā)病過程的主要機制[1]。脂氧素（LX）主要在炎癥等病理過程中合成，同時具有抗炎和促炎癥消退作用[2]，對機體多器官缺血再灌注損傷具有保護作用，但對MIRI保護作用的研究較少。本實驗在大鼠MIRI發(fā)生前后使用LXA4，觀察是否通過影響細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激和心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，發(fā)揮其心肌保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 成年健康雄性SD大鼠72只，手術(shù)前體重200~250g，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。LXA4溶液購自美國Cayman公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒、TUNEL凋亡試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IL-1β、IL-8、肌鈣蛋白I（cTnI）試劑盒購自上海博蘊生物技術(shù)有限公司；高純氮氣購自溫州申鹿氣體有限公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠MIRI模型的制作 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，股靜脈穿刺抽血，行氣管插管，接小型動物呼吸機（潮氣量5ml，頻率70次/min），接心電監(jiān)護儀監(jiān)測心電變化。開胸，于肺動脈圓錐及左心房間找出冠狀動脈左前降支，用無創(chuàng)縫合絲線置于左前降支起始部處備用，將絲線兩端套一小塑料墊片，再穿入聚乙烯小管以形成環(huán)路，穩(wěn)定10min后輕輕抽緊絲線兩端，推套管緊貼心壁以阻斷左冠狀動脈血流，30min后切斷結(jié)扎線恢復(fù)再灌注。結(jié)扎成功的標(biāo)志：心電圖導(dǎo)聯(lián)上ST段弓背上抬0.1mV或T波高聳、QRS波群變高變寬和心肌顏色變?yōu)榍嘧仙?。再灌注成功的?biāo)志：心電圖導(dǎo)聯(lián)上ST段壓低≥1/2、心肌顏色轉(zhuǎn)紅。

1.2.2 分組及檢測方法 72只SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為6組，每組12只。假手術(shù)一組（C1組），除穿線不結(jié)扎冠狀動脈左前降支外，其余同I/R1組；假手術(shù)二組（C2組），除穿線不結(jié)扎冠狀動脈左前降支外，其余同I/ R2組；MIRI一組（I/R1組）：除股靜脈注射的藥物改為0.9%氯化鈉溶液（2ml/kg）外，其余同LX1組；MIRI二組（I/R2組）：除股靜脈注射的藥物改為0.9%氯化鈉溶液（2ml/kg）外，其余同LX2組；缺血再灌注前用藥組（LX1組）：大鼠在麻醉后開胸前股靜脈注射LXA4100μg/kg（氮吹儀吹去溶劑乙醇后加至2ml/kg的0.9%氯化鈉溶液中），然后開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支，30min后再次暴露心臟，切斷結(jié)扎線再灌注120min；缺血再灌注后用藥組（LX2組）：大鼠麻醉后開胸結(jié)扎冠狀動脈左前降支，30min后再次暴露心臟，切斷結(jié)扎線，灌注30min后股靜脈注射LXA4100μg/kg（同LX1組），接著再灌注90min。

各組大鼠于麻醉后開胸前即刻取血（T1），實驗結(jié)束后取血（T2），其中T2在C1組、C2組于穿線后150min后取血；其余各組于再灌注120min后取血。取血后剖取大鼠心臟，取部分心肌迅速置于4℃預(yù)冷的2.5%的戊二醛溶液中，充分搖晃，而后置于4℃冰箱中固定2h以上備用；部分心肌以4%多聚甲醛固定、石蠟包埋行心肌細(xì)胞凋亡檢測；另取部分心肌組織，置于液氮凍存，最后置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 心肌組織超微結(jié)構(gòu) 標(biāo)本經(jīng)PBS緩沖液漂洗、1%餓酸固定、雙蒸水漂洗、1%醋酸鈾染色、梯度脫水、浸透后，45℃烘箱3~6h包埋聚合、修塊、超薄切片，透射電鏡下觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)。

1.3.2 心肌原位凋亡細(xì)胞 用TUNEL原位法測定凋亡細(xì)胞，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。細(xì)胞核呈棕褐色或棕黃色顆粒且具備凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征判定為凋亡細(xì)胞。Image-Pro Plus v 5.1圖像分析軟件自動選取最有意義的5個視野，每個視野計算陽性細(xì)胞所占全部細(xì)胞的百分率，最后計算均值，獲得凋亡細(xì)胞的百分率，凋亡率（%）=（凋亡細(xì)胞核計數(shù)/總細(xì)胞核計數(shù)）×100%。

1.3.3 IL-1β、IL-8、cTnI的測定 采用雙抗體夾心生物技術(shù)，按試劑盒說明將一定量的生物素標(biāo)記二抗和酶標(biāo)試劑加入血清或標(biāo)準(zhǔn)品中，獲得樣本的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對應(yīng)的OD值計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，再根據(jù)各樣本的OD值在回歸方程上計算出對應(yīng)的樣本濃度。

1.3.4 SOD、MDA的測定 取凍存的心肌組織，準(zhǔn)確稱取組織重量，以相應(yīng)的試劑為勻漿介質(zhì)，制成5%的組織勻漿，不進行離心，按試劑盒說明測得各樣本的OD值，根據(jù)相關(guān)公式得出結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以 表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心肌組織的病理學(xué)變化 C1組、C2組大鼠心肌電鏡顯示：肌絲排列規(guī)則，閏盤結(jié)構(gòu)清晰；線粒體豐富，大小形態(tài)正常，呈圓形或橢圓形，膜完整，嵴結(jié)構(gòu)清晰，無腫脹；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈圓形或橢圓形鑲嵌于肌絲及基質(zhì)中。I/R1組、I/R2組大鼠心肌電鏡顯示：肌絲排列紊亂，大量肌絲斷裂、融合、消失，閏盤結(jié)構(gòu)不清；線粒體形態(tài)異常,高度腫脹，膜溶解，嵴結(jié)構(gòu)模糊，消失形成空泡，空泡面積很大，線粒體間糖原顆粒消失；大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡形成。LX1組、LX2組大鼠心肌電鏡顯示：肌絲排列稍稀疏，少部分肌絲斷裂，閏盤結(jié)構(gòu)模糊；線粒體稍腫脹，嵴間隙增寬，嵴結(jié)構(gòu)較清晰，少部分線粒體嵴溶解；少部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成空泡。見圖1。

2.2 各組大鼠心肌組織中SOD、MDA含量及心肌細(xì)胞凋亡率比較 見表1。

圖1 各組大鼠心肌組織電鏡觀察結(jié)果（A：C1組心肌組織,B：C2組心肌組織,C：I/R1組心肌組織,D：I/R2組心肌組織,E：LX1組心肌組織,F：LX2組心肌組織；×20 000）

表1 各組大鼠心肌組織中SOD、MDA含量及心肌細(xì)胞凋亡率比較

注：與C1組比較，*P＜0.05；與C2組比較，△P＜0.05；與I/R1組比較，▲P＜0.05；與I/R2組比較，#P＜0.05

由表1可見，I/R1、I/R2及LX1、LX2與C1、C2組比較，心肌細(xì)胞凋亡率、SOD、MDA均增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。LX1組與I/R1組、LX2組與I/R2組比較，心肌細(xì)胞凋亡率、MDA含量降低，而SOD活性顯著增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.3 各組大鼠IL-1β、IL-8、cTnI濃度的變化 見表2。

由表2可見，各組T1時各指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。T2與T1時比較，除C1組、C2組IL-8、cTnI差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），其余各組IL-1β、IL-8及cTnI均增高（均P＜0.05）。I/R1、I/R2及LX1、LX2與C1、C2組比較，IL-1β、IL-8、cTnI增高，LX1組與I/R1組、LX2組與I/R2組相比，IL-1β、IL-8、cTnI降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表2 各組大鼠T1、T2時血清IL-1β、IL-8、cTnI濃度比較

3 討論

臨床上，MIRI現(xiàn)象較為常見，如何減輕MIRI一直是心血管領(lǐng)域研究的重點與難點，其中對MIRI機制的探討是如何治療的前提。MIRI的機制復(fù)雜，包括諸多因素，其中較為公認(rèn)的有氧自由基損傷，鈣離子超載，微血管損傷和中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等聚集、活化產(chǎn)生炎性介質(zhì)等。LX是花生四烯酸脂加氧酶的代謝產(chǎn)物，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮廣泛的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，已有的研究表明LX對多種臟器缺血再灌注損傷有一定的保護作用[3-5]，但LXA4對MIRI心肌超微結(jié)構(gòu)的影響報道較少。故本實驗在大鼠MIRI前后使用LXA4，觀察其能否通過抑制促炎因子、氧自由基損傷，降低細(xì)胞凋亡來減輕心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，發(fā)揮心肌保護作用。

心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)可以從組織形態(tài)學(xué)角度更精細(xì)地反應(yīng)心肌損傷的病理變化，本實驗采用高分辨率電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，I/R1、I/R2組與C1組、C2組相比，肌絲明顯排列紊亂、溶解、消失，閏盤結(jié)構(gòu)不清，線粒體高度腫脹，嵴結(jié)構(gòu)模糊，大量內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡形成。而LX1、LX2組電鏡顯示，只有少部分肌絲斷裂，閏盤結(jié)構(gòu)稍模糊，線粒體稍腫脹，嵴結(jié)構(gòu)較清晰，少部分內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形成空泡。同時LX1、LX2組比I/R1、I/R2組cTnI明顯下降，說明LXA4可以減輕心肌損傷，對MIRI心肌超微結(jié)構(gòu)具有保護作用。

缺血再灌注對心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷機制目前未完全清楚。El Kebir等[6]報道LX可以抑制中性粒細(xì)胞在炎癥部位的聚集；調(diào)節(jié)促炎/抗炎因子的平衡；另有研究表明LXA4可以抑制細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生[7]。本實驗從LX各組與I/R各組的比較結(jié)果顯示，LXA4能明顯抑制IL-1β、IL-8的產(chǎn)生，減輕心肌的炎性損傷。IR1、IR2組SOD、MDA明顯升高，表明MIRI后心肌存在過氧化應(yīng)激，心肌清除自由基的能力下降，導(dǎo)致心肌損傷；使用LXA4后SOD活性顯著提高，氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化損傷減輕，MDA含量降低，表明LXA4可減輕MIRI所致的心肌組織自由基損傷，對恢復(fù)機體的氧化/抗氧化平衡起重要作用。I/R各組線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)模糊提示心肌細(xì)胞的底物和能量障礙，線粒體是細(xì)胞呼吸和氧化的中心，機體攝入的90%的氧在線粒體內(nèi)進行氧化磷酸化，1%~2%的氧從線粒體呼吸鏈中逸出形成活性氧，活性氧生成增加可降低線粒體效能，還可攻擊線粒體內(nèi)膜脂質(zhì)和蛋白，引起線粒體腫脹；線粒體既是細(xì)胞內(nèi)活性氧的主要來源，也是活性氧攻擊的主要靶標(biāo)[8]。線粒體對氧自由基的毒性作用非常敏感，使用LXA4后線粒體腫脹明顯減輕，嵴結(jié)構(gòu)變清晰，心肌超微結(jié)構(gòu)受到很好地保護，表明LXA4可能是通過抑制線粒體產(chǎn)生的氧自由基作用于線粒體膜來實現(xiàn)對線粒體的保護作用。

近年的研究表明MIRI還存在著凋亡機制，給予適當(dāng)?shù)乃幬锔深A(yù)措施，可減少心肌細(xì)胞的凋亡。本實驗中缺血再灌注組、藥物治療組與相應(yīng)對照組比較，心肌細(xì)胞凋亡率顯著增高，意味著MIRI可增加心肌細(xì)胞的凋亡。使用LXA4能使凋亡率顯著降低，表明LXA4可明顯減少心肌細(xì)胞的凋亡，從而減輕心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷。Rosca等[9]認(rèn)為心肌細(xì)胞的凋亡并不是心肌缺血本身誘導(dǎo)的，而是受到再灌注期間細(xì)胞周圍環(huán)境的影響，本實驗結(jié)果表明LXA4可以降低心肌細(xì)胞的氧化損傷，可能是減少心肌細(xì)胞凋亡的潛在機制。Qiu等[10]報道心肌缺血可使COX-1介導(dǎo)的前列腺素生成，而前列腺素可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，LX對前列腺素的作用也可能是影響細(xì)胞凋亡的原因之一。雖然LXA4可抑制MIRI心肌細(xì)胞的凋亡，但具體機制有待進一步研究。

綜上所述，本研究結(jié)果表明LXA4通過抑制MIRI的炎癥反應(yīng)，氧化應(yīng)激損傷，降低心肌細(xì)胞凋亡來減輕心肌超微結(jié)構(gòu)的損傷，而MIRI損傷最直接反映在心肌超微結(jié)構(gòu)的變化上，所以可以推斷LXA4對大鼠MIRI起明顯的保護作用。LXA4不穩(wěn)定，半衰期短，故使用LXA4的最佳劑量、最佳時機、給藥方式、給藥次數(shù)等都有待進一步研究；以這些介質(zhì)結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)研發(fā)相應(yīng)的穩(wěn)定類似物是今后研究者努力的方向。

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Protective effect of lipoxinA4on myocardial ultrastructure upon ischemia-reperfusion injury in rats

SHAO Lan,ZHAO Qifeng,LI

Feng,et al.Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery,Yuying Children's Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325027,China

【 Abstract】Objective To investigate the protective effect of lipoxinA4(LXA4)on myocardial ultrastructure upon ischemia-reperfusion injury (MIRI)in rats. Methods Seventy-two male SD rats were randomly divided into six groups with 12 in each group:sham operation group1(group C1),sham operation group2(group C2),MIRI group1(group I/R1),MIRI group2(group I/R2), pre-MIRI treatment group1 (group LX1),post-MIRI treatment group2 (group LX2).The rat model of MIRI was established,blood was taken in each group before chest opening(T1)and at the end of the experiment(T2).The serum IL-1β,IL-8,cTnI concentrations were measured and at the same time the SOD activity and MDA contents were determined,myocardial cell apoptosis was detected with TUNEL method,while the ultrastructural changes of cardiac muscle were observed under electron microscope. Results In group I/R1,LX1(compared with group C1)and group I/R2,LX2(compared with group C2),the serum IL-1β,IL-8,cTnI concentrations (all at T2),SOD activity,MDA contents and the apoptotic index increased significantly(P＜0.05).In group LX1(compared to group I/R1)and group LX2(compared to group I/R2),lipoxinA4significantly reduced the serum IL-1β,IL-8,cTnI concentrations(all at T2),the MDA contents and the apoptotic index,but increased SOD activity(P＜0.05).At the same time,myocardial ultrastructural injury improved significantly,mitochondria arranged in rows,electron density increased,swelling and vacuolization reduced. Conclusion LXA4has protective effect against MIRI in rats through inhibition of pro-inflammatory cytokines, oxygen free radicals and the cell apoptosis to attenuate myocardial ultrastructural injury.

Myocardial ischemia-reperfusion injury Lipoxin Oxidative stress Apoptosis Ultrastructure

2012-11-06）

（本文編輯：馬雯娜）

浙江省教育廳科研計劃項目（Y200804950）；浙江省外科學(xué)重中之重學(xué)科開放基金資助項目（2011MZ005）；浙江省衛(wèi)生廳重點支撐學(xué)科-小兒外科學(xué)基金資助項目（11-ZC27）

325027 溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英兒童醫(yī)院心胸外科

陳其，E-mail:cqq57@126.com