陳聰?shù)?吳碎春 陳肖鳴 張華 李仲榮 趙一鳴

紅花對兔腸缺血再灌注損傷后微循環(huán)改善作用的研究

陳聰?shù)?吳碎春 陳肖鳴 張華 李仲榮 趙一鳴

目的 探討紅花對兔腸缺血再灌注損傷（IRI）時微循環(huán)的改善作用。 方法 將30只日本大耳兔隨機分為假手術(shù)組（S組）、缺血再灌注組（IR組）和缺血再灌注+紅花注射液組（SI組）。制作在體兔IRI模型。觀察和記錄各組動物腸系膜微循環(huán)變化，包括微動脈管徑（AD）、微靜脈管徑（VD）、微動脈流速（AFV）、微靜脈流速（VFV）和白細胞黏附數(shù)，電鏡下觀察腸黏膜超微結(jié)構(gòu)改變。 結(jié)果 IR組腸系膜微動、靜脈管徑縮小，血流速度減慢，多數(shù)腸黏膜微結(jié)構(gòu)破壞嚴重。SI組微動、靜脈管徑及血流速度明顯改善，腸黏膜超微結(jié)構(gòu)異常改變不同程度減輕。 結(jié)論 在兔腸IRI發(fā)生后使用紅花注射液能有效改善腸系膜的微循環(huán)，從而對腸黏膜起到良好的保護作用。

紅花 缺血再灌注損傷 超微結(jié)構(gòu) 微血管

腸缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury,IRI）日益受到人們的重視，其發(fā)生、發(fā)展機制及防治措施的研究已成為危重病醫(yī)學(xué)的重點課題之一。紅花是菊科草本植物紅花的干燥花，是活血化瘀的傳統(tǒng)中藥之一。實驗證明,紅花制劑紅花注射液有擴張血管、降低血管阻力、增加血流量、抑制血小板聚集、增加與改善纖維蛋白溶酶活性、防止血栓形成與發(fā)展、促進血栓溶解等作用,同時可降低血液黏度,提高組織耐缺氧能力,對缺血缺氧狀態(tài)下的組織有保護作用[1]。有關(guān)紅花通過改善組織微循環(huán)以及抗自由基、抗氧化等藥理作用,減輕心、腦、腎等組織的IRI的報道已較多,但對腸組織的IRI的保護作用研究甚少，尤其對腸微循環(huán)的調(diào)控作用報道更少。本研究通過制作實驗兔腸IRI模型，探討紅花注射液對其微循環(huán)變化的影響，為臨床防治腸IRI提供新的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組及模型建立 30只健康日本大耳白兔（雌16只，雄14只），體重1.7～2.6kg，平均2.17kg，由溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。采用隨機分組法將動物分為3組，每組10只。（1）假手術(shù)組（S組），分離腸系膜上動脈（SMA），但不夾閉，于首次抽血前15min經(jīng)耳緣靜脈注射0.9%氯化鈉注射液5.0ml/kg。（2）腸缺血再灌注組（IR組），參照Moore等[2]的方法制作在體兔腸IRI模型，在兔耳緣靜脈注射戊巴比妥鈉30mg/kg麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺上，行股動脈插管測壓，同側(cè)股靜脈插管用微量泵持續(xù)輸注0.9%氯化鈉注射液10ml/（kg·h）；腹部備皮消毒，腹正中線切口入腹腔，游離小腸SMA，用無創(chuàng)微動脈夾夾閉其根部60min制成腸缺血模型（依據(jù)腸系膜血管搏動消失、腸管顏色蒼白確定）；缺血后松夾即成為腸IRI模型（腸系膜血流恢復(fù)依據(jù)腸系膜血管搏動恢復(fù)、腸管顏色恢復(fù)確定）。于恢復(fù)血供前15min經(jīng)耳緣靜脈注射0.9%氯化鈉注射液5.0ml/kg。（3）腸缺血再灌注+紅花注射治療組（SI組），于恢復(fù)血供前15min經(jīng)耳緣靜脈注射紅花注射液（湖北宜昌民康制藥廠產(chǎn)品，20ml/支）5.0ml/kg。

1.2 微循環(huán)測量與觀察 在觀察腸系膜微循環(huán)前10min自兔腹腔注入20%烏拉坦（5ml/kg）麻醉，沿兔腹部右側(cè)作一縱行切口，打開腹腔，輕輕拉出一段小腸腸袢，固定于微循環(huán)顯微鏡載物臺的恒溫（37℃）灌流盒上；將微循環(huán)顯微鏡與圖像分析系統(tǒng)連接，觀察和記錄各組大鼠腸系膜微循環(huán)變化。腸系膜微循環(huán)指標包括微動脈管徑（AD）、微靜脈管徑（VD）、微動脈流速（AFV）、微靜脈流速（VFV）、白細胞黏附數(shù)。微血管管徑測定采用顯微電視法：取血管走行較直段，與血管縱軸垂直方向測血管直徑3次，取平均值。微循環(huán)血流速度測定采用光點同步掃描法。白細胞黏附數(shù)測定以100μm長微靜脈內(nèi)皮上黏附而不滾動超過30s的白細胞定義為黏附的白細胞，觀察、比較時分為≤5個、6～10個、11～15個、16～20個4級。

1.3 腸組織電鏡檢查 各組動物實驗結(jié)束時迅速處死，取出損傷腸段，用冰鹽水沖洗腸組織黏膜面，制成2mm×2mm大小的樣本，用2.5%戊二醛以及1%鋨酸雙重固定后包埋，用LKB2V型超薄切片機切片，H600型投射電鏡觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。所有計量數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布，以 表示，組間比較采用方差分析。計數(shù)資料組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗。

2 結(jié)果

2.1 3組動物腸系膜微血管管徑和血流速度的比較 見表1。

表1 3組動物腸系膜微血管管徑和血流速度的比較

由表1可見，IR組的AD及VD較S組明顯縮小，而注射了紅花注射液的SI組AD及VD較IRI組明顯擴大；IR組的AFV及VFV較SI組明顯減慢，而SI組的AFV及VFV較IR組明顯加快。

2.2 3組動物腸系膜微循環(huán)內(nèi)白細胞黏附數(shù)比較 隨著缺血肢體再灌注的發(fā)生，IR組白細胞邊集現(xiàn)象明顯，發(fā)生白細胞滾動和貼壁現(xiàn)象的動物只數(shù)較S組明顯為多（P＜0.05）；但注射紅花注射液的SI組白細胞黏附現(xiàn)象明顯減輕，發(fā)生白細胞滾動和貼壁的動物只數(shù)較IR組明顯減少（P＜0.05），詳見表2。

表2 3組動物不同程度白細胞黏附數(shù)的比較（例）

2.3 3組動物腸組織超微結(jié)構(gòu)的改變 電鏡下腸組織超微結(jié)構(gòu)顯示清晰，各組改變情況如下：S組腸組織結(jié)構(gòu)未見異常（圖1a）。IR組多數(shù)腸黏膜上皮細胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)液泡增多，大多數(shù)線粒體呈不同程度的腫脹，嚴重者可見嵴減少或消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張較明顯，細胞表面微絨毛數(shù)量明顯減少且排列較亂，部分微絨毛有腫脹、融合現(xiàn)象，上皮細胞間隙擴大，連接較疏松。黏膜下間質(zhì)可見少量的漿細胞浸潤現(xiàn)象，部分毛細血管周圍可見水腫現(xiàn)象（圖1b）。SI組多數(shù)腸黏膜上皮細胞腫脹減輕，胞質(zhì)內(nèi)液泡減少，大多數(shù)線粒體腫脹減輕或恢復(fù)正常狀態(tài)，僅有少量線粒體仍有腫脹；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張現(xiàn)象減少，細胞表面微絨毛較豐富，且排列較整齊，罕見微絨毛腫脹現(xiàn)象。上皮細胞間連接較致密，間隙縮小。黏膜下間質(zhì)可見多量的漿細胞浸潤現(xiàn)象，毛細血管周圍水腫明顯減輕（圖1c）。

3 討論

紅花注射液從中草藥紅花中提取而成，具有抑制血小板聚集，血栓形成，擴張血管，改善微循環(huán)，以及良好的抗氧化、清除自由基等作用[2-3]。已有研究表明，紅花在IRI時對腦、心、肺、腎等臟器有保護作用[4-7]，但對腸道的作用未見報道。腹股溝嵌頓性斜疝、腸套疊等是小兒外科的常見疾??；而這些腸道缺血性疾病的病理生理基礎(chǔ)就與腸IRI有關(guān)。腸黏膜對缺血缺氧尤為敏感，腸黏膜損傷是腸IRI的主要特征，表現(xiàn)為廣泛的功能障礙、黏膜屏障的通透性增高、腸道細菌的移位、毒素的吸收及遠處器官的損傷，出現(xiàn)嚴重的臨床癥狀和并發(fā)癥，給臨床診治帶來困難。因此研究中藥紅花對IRI后腸黏膜的保護作用具有現(xiàn)實的臨床意義。

圖1 3組動物腸黏膜電鏡下超微結(jié)構(gòu)（a：S組；b：IR組；c：SI組；×8 000）

腸IRI是一個動態(tài)連續(xù)的病理過程，其發(fā)生機制錯綜復(fù)雜，目前認為IRI后出現(xiàn)的全身性急性炎癥反應(yīng)中，多種炎癥介質(zhì)及細胞因子的產(chǎn)生和釋放是導(dǎo)致繼發(fā)多器官損傷的中心環(huán)節(jié)。而炎癥介質(zhì)、細胞因子等是具有血管活性的生物因子，其平衡失調(diào)可以導(dǎo)致微循環(huán)功能障礙。本研究結(jié)果顯示，兔IRI后腸系膜微循環(huán)有特征性改變，主要表現(xiàn)為IRI模型形成后早期腸系膜微動、靜脈管徑縮小，血流速度減慢，部分毛細血管閉塞，血流停滯。由此可見，IRI時存在的明顯微循環(huán)異常，可能參與了IRI病理演變過程。研究結(jié)果還表明，使用紅花的SI組使腸系膜微動、靜脈管徑增大，血流速度明顯加快，可以有效改善腸系膜血管微循環(huán)。

本研究通過電鏡下超微結(jié)構(gòu)的觀察也證實，腸IRI導(dǎo)致多數(shù)腸黏膜上皮細胞腫脹，胞質(zhì)內(nèi)液泡增多，大多數(shù)線粒體呈不同程度的腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張較明顯，細胞表面微絨毛數(shù)量明顯減少且排列較亂，部分微絨毛有腫脹、融合現(xiàn)象，這些均是IRI的病理基礎(chǔ)。使用紅花后多數(shù)腸黏膜超微病理結(jié)構(gòu)異常改變明顯減輕甚或消失，說明紅花可有效減少炎性滲出，抑制微循環(huán)通透性的增加，阻斷腸IRI進展的病理生理過程，對腸黏膜超微結(jié)構(gòu)有良好的保護作用。

綜上所述，腸IRI可引起腸微循環(huán)明顯異常，而紅花可明顯改善腸系膜微循環(huán)狀態(tài)，可用于防治腸IRI。

[1] 韓鑫.腸缺血再灌注損傷防治研究進展 [J].中華小兒外科雜志, 1999,20(1):45-46.

[2] Koike K,Moore E E,Moore F A,et al.Gut phospholipase A2 mediates neutrophil priming and lung injury after mesenteric ischemia-reperfusion[J].Am J Physiol,1995,268(3 Pt 1):G397-403.

[3] 聶瓊嶸.紅花黃色素的藥代動力及藥理作用研究近況[J].時珍國醫(yī)國藥,2003,14(8):503-505.

[4] 鄭為超,陳鐸葆,李兵,等.紅花黃素對大鼠心肌缺血-再灌注模型的作用及機制研究[J].中國藥理學(xué)通報,2003,19(9):1032-1034.

[5] 趙晴,杜建時,韓雪梅,等.大鼠急性全腦缺血再灌注損傷后細胞凋亡及紅花保護作用的研究[J].中國實驗診斷學(xué),2004,8(1):21-23.

[6]張曉隆,徐正衸,王萬鐵,等.肺缺血再灌注損傷時TXA_2/PGI_2平衡的變化及紅花的調(diào)控作用[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2004,34(5):328-330.

[7] 高飛,吳小候,羅春麗,等.紅花注射液對大鼠腎缺血再灌注損傷Caspase-3和bcl-2表達的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006,31 (4):532-536.

Effect of safflor injection on mesenteric microcirculation of rabbits following intestine ischemia/reperfusion injury

CHEN Congde,WU

Suichun,CHEN Xiaoming,et al.Department of Pediatric Surgery,Yuying Children Hospital of Wenzhou Medical College,Wenzhou 325027,China

【 Abstract】Objective To determine the inhibitory effect of safflor injection (Sal I)on mesenteric microcirculation following intestine ischemia and reperfusion injury in rabbits. Methods Thirty rabbits were randomly divided into three groups:control group,ischemia/reperfusion group(group IR)and safflor injection group(group SI).Mesenteric microcirculation,including arterial diameter,venous diameter,arterial flow velocity and venous flow velocity，was recorded.The ultrastructure of the intestine tissue was observed. Results The abnormal morphological changes of intestine cells under electric microscope were more marked in the group IR.The diameter of mesenteric microcirculation was enlarged in group SI than that in group IR.Blood flow velocity were faster in SI than that in IR.The abnormal morphological changes of intestine cells were alleviated markedly in SI group. Conclusion Safflor injection can effectively improve mesenteric microcirculation and protect morphological structure of intestine cells from ischemia/reperfusion injury.

Safflor Ischemia/reperfusion injury Ultrastructure Microcirculation

2012-06-11）

（本文編輯：沈叔洪）

溫州市科技局資助項目（Y20100065）

325027 溫州醫(yī)學(xué)院附屬育英醫(yī)院小兒外科通信作者：趙一鳴，E-mail：zym81835132@126.com