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        腦膠質(zhì)瘤中脂肪酸酰胺水解酶的表達(dá)及意義

        2013-04-18 03:50:17張小林蔣峰龔清永韓麗君任杰林志雄傅瑾
        浙江醫(yī)學(xué) 2013年4期
        關(guān)鍵詞:水解酶烯酸內(nèi)源性

        張小林 蔣峰 龔清永 韓麗君 任杰 林志雄 傅瑾

        腦膠質(zhì)瘤中脂肪酸酰胺水解酶的表達(dá)及意義

        張小林 蔣峰 龔清永 韓麗君 任杰 林志雄 傅瑾

        目的 研究內(nèi)源性大麻素代謝酶脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)情況及其與膠質(zhì)瘤病理級別的關(guān)系,探討其臨床意義。 方法 選取首次手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本23例,其中WHOⅠ級1例,Ⅱ級7例,Ⅲ級5例,Ⅲ~Ⅳ級2例,Ⅳ級8例。另取8例因顱腦外傷行內(nèi)減壓術(shù)切除的正常腦組織作為對照。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分別檢測各組織標(biāo)本中FAAH mRNA和FAAH活性的表達(dá)。 結(jié)果 FAAH mRNA、FAAH活性在低級別(WHOⅠ~Ⅱ級)和高級別(WHOⅢ~Ⅳ級)腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)水平較正常腦組織明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01),且隨著腫瘤病理級別的增高而降低,與腫瘤的病理分級呈負(fù)相關(guān)(均P<0.01)。FAAH mRNA與FAAH活性的表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.01)。 結(jié)論 FAAH可能參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程,檢測FAAH的表達(dá)可評價(jià)腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為,為腦膠質(zhì)瘤的臨床治療和預(yù)后判斷提供參考。

        大麻素 花生四烯酸乙醇胺 FAAH 膠質(zhì)瘤

        腦膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,據(jù)報(bào)道約占原發(fā)性腦腫瘤的45%~50%,患者的5年生存率僅為12%~15%[1]。近年來,大量研究表明內(nèi)源性大麻素及其相關(guān)藥物能在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中抑制膠質(zhì)瘤的生長[2]。目前,尚未見腦膠質(zhì)瘤中內(nèi)源性大麻素代謝酶脂肪酸酰胺水解酶(FAAH)與腫瘤病理級別關(guān)系的研究,本文擬通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC-MS)檢測FAAH在腦膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達(dá),探討其與腫瘤病理級別的內(nèi)在聯(lián)系,為膠質(zhì)瘤的治療和預(yù)后判斷提供參考,也為內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)抗膠質(zhì)瘤的研究提供理論依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 組織標(biāo)本 選擇福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科2007—2008年首次手術(shù)切除并經(jīng)病理檢查證實(shí)的腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本23例,患者臨床資料齊全,術(shù)前均未行放療、化療和免疫治療,無其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病史、精神病史和毒物接觸史。正常腦組織標(biāo)本8例作為對照,均為腦外傷行內(nèi)減壓術(shù)切除的腦組織。一部分標(biāo)本用液氮速凍,-80℃冰箱保存;另一部分用甲醛溶液固定,作常規(guī)病理組織學(xué)和免疫組織化學(xué)染色檢測。參照2007年WHO神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類分級標(biāo)準(zhǔn),其中Ⅰ級1例,Ⅱ級7例,Ⅲ級5例,Ⅲ~Ⅳ級2例,Ⅳ級8例。本研究將組織標(biāo)本分為3組:正常腦組織組(8例)、低級別腦膠質(zhì)瘤組(Ⅰ~Ⅱ級,8例)和高級別腦膠質(zhì)瘤組(Ⅲ~Ⅳ級,15例)。1.2 qRT-PCR檢測 (1)組織總RNA的提?。阂旱卵欣彿鬯榻M織塊。按照Trizol試劑說明書推薦的步驟操作。按照文獻(xiàn)[3]報(bào)道的方法檢測RNA的濃度、純度和完整性。(2)cDNA的合成:使用ToYoBo公司的ReverTra Ace qPCR RT Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),所有操作均在冰上完成,總反應(yīng)體系為10μl。取總RNA1μg,加DEPC水至7μl,65℃加熱5min,冰上放置3min,依次加入5xRT Buffer 2μl、RT Enzyme mix 0.5μl、Primer mix 0.5μl,混勻后37℃15min、98℃5min、4℃10min,即得到逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA),加滅菌純水稀釋至10倍,-20℃保存?zhèn)溆?。⑶rt-PCR:以逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。PCR所用引物由Oligo 6軟件設(shè)計(jì),上海生工生物工程有限公司合成。FAAH引物正義為:5′-AAAACCGTGATTGCCCAGTG-3′,反義為:5′-TCCCCAAAGTAGCCCCTGTAA-3′;GAPDH引物正義為:5′GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,反義為:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR所用試劑為TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒,反應(yīng)體系為20μl:SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10μl、Forward Primer 0.8μl、Reverse Primer 0.8μl、ROX Reference Dye 0.4μl、cDNA 8μl。置于ABI7300熒光定量PCR儀上按下列條件擴(kuò)增:95℃30s預(yù)變性,95℃5s、60℃31s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán),然后95℃15s、60℃1min、95℃15s。PCR完成后,由ABI 7300 System SDS Software軟件進(jìn)行分析,在調(diào)整基線循環(huán)和計(jì)算域值后,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出待測基因的表達(dá)水平,將待測基因表達(dá)量/管家基因GAPDH表達(dá)量的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        1.3 FAAH活性測定 按照BCA法測定組織蛋白的濃度,用80 μg蛋白進(jìn)行FAAH活性測定。在50 mM Tris-HCL(pH8.0)含有0.05%BSA緩沖液內(nèi)加入80 μg蛋白、25 M AEA,混合均勻,在37℃下反應(yīng)30 min。以上反應(yīng)中加入含有1 nmol 17∶0脂肪酸內(nèi)標(biāo)的甲醇終止液200μl終止反應(yīng),HPLC-MS分析水解反應(yīng)產(chǎn)物含量。HPLC-MS條件:Agilent 1200 series型號液相色譜儀,ABI 3200 Q TrapLC/MS/MS system型號質(zhì)譜儀,Agilent ZOR BAX Eclipse XDB-C18column(4.6mm×150 mm,1.8 μm)型號液相色譜柱,柱溫保持在40℃,進(jìn)樣量5μl,流動(dòng)相A:水(含0.25%醋酸和5 mM醋酸銨),流動(dòng)相B:甲醇,流速0.6 ml/min,95%B洗脫5 min。質(zhì)譜為ESI(-)離子源,干燥氣為N2,溫度350℃,掃描質(zhì)量范圍50~400 amu。結(jié)果以17∶0脂肪酸m/z=269作為內(nèi)標(biāo)對FAAH水解產(chǎn)物FAAH m/z=303進(jìn)行定量分析。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以 表示,組間比較采用 Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)。FAAH mRNA、FAAH活性與腦膠質(zhì)瘤病理級別的相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。FAAH mRNA與FAAH活性的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。

        2 結(jié)果

        2.1 FAAH表達(dá)水平和FAAH活性在正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 見表1。

        表1 正常腦組織和各級別膠質(zhì)瘤組織中FAAH表達(dá)水平的比較

        由表1可見,所有組織中均能檢測到FAAH mRNA的表達(dá),在正常腦組織中呈高表達(dá),而在腦膠質(zhì)瘤組織中呈低表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;并且,F(xiàn)AAH mRNA的表達(dá)量與膠質(zhì)瘤的病理級別呈負(fù)相關(guān)(r=-0.77,P<0.01)。此外,所有組織中還可檢測到FAAH活性,正常腦組織FAAH活性明顯高于腦膠質(zhì)瘤組織,差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;并且,F(xiàn)AAH活性與膠質(zhì)瘤的病理級別也呈負(fù)相關(guān)(r=-0.68,P<0.01)。

        2.2 FAAH表達(dá)水平與FAAH活性的關(guān)系 將每個(gè)組織樣本的FAAH mRNA/GAPGH mRNA的比值與該組織的FAAH活性進(jìn)行Pearson相關(guān)分析(圖1),結(jié)果顯示,F(xiàn)AAH表達(dá)水平與FAAH活性之間具有明顯的正相關(guān)關(guān)系(r=0.598,P<0.01)。

        圖1 FAAH表達(dá)水平與FAAH活性的關(guān)系

        3 討論

        大麻(Marijuana,植物學(xué)名Cannabissativa)其主要的活性成分是Δ9-四氫大麻酚(deltatetrahydrocannabinol,Δ9-THC),既是毒品,又是具有抑制細(xì)胞生長、抗炎癥、抑制腫瘤生長的治療藥物[4]。大麻素受體是指對大麻類物質(zhì)如Δ9-THC有應(yīng)答作用的受體,廣泛分布于人體各組織系統(tǒng)。內(nèi)源性大麻素是指機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生的具有與Δ9-THC相似的空間三維結(jié)構(gòu),并能與大麻素受體相結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)的花生四烯酸的衍生物。迄今為止,已經(jīng)鑒定出5種內(nèi)源性大麻素[5]:花生四烯酸乙醇胺(anandamide,AEA),2-花生四烯酸甘油(2-arachidonylglycerol,2-AG),2-花生四烯酸甘油醚(2-arachidonylglycerolether,2-AGE),油酰乙醇胺(oleoylethanolamide,OEA),花生四烯酸多巴胺(N-arachidonyldopamine,NADA)。

        AEA是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)并從體內(nèi)分離出來的內(nèi)源性大麻素。AEA可通過增加神經(jīng)酰胺從頭合成抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其發(fā)生早期凋亡[6];另還可作用于辣椒素受體,增加細(xì)胞內(nèi)鈣濃度,激活環(huán)氧合酶,釋放細(xì)胞色素C和激活天冬氨酸蛋白水解酶caspase 3,誘導(dǎo)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤和C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡[7]。Jacobsson等[8]發(fā)現(xiàn),AEA可激活大麻素受體和辣椒素受體,引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞的氧化應(yīng)激;激活鈣蛋白酶(calpain),引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載而抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。1971年,F(xiàn)olkman首次提出腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移是一個(gè)依賴血管形成的過程,因此,阻止新生血管的形成成為抑制腫瘤生長的一個(gè)基本的治療策略[9]。AEA通過抑制成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、毛細(xì)樣管道的形成和基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的降解活性來抑制腫瘤新生血管的形成[10]。

        哺乳動(dòng)物體內(nèi)AEA主要在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)由FAAH直接降解成花生四烯酸和乙醇胺[11]。FAAH是一種屬于絲氨酸水解酶家族的膜酶,由579個(gè)氨基酸組成,主要定位于微粒體和線粒體,廣泛分布于機(jī)體的各個(gè)部位,在大腦和肝臟中的濃度較高[12]。迄今為止,關(guān)于AEA的水解酶FAAH與腫瘤發(fā)生或發(fā)展相關(guān)的研究甚少。在小鼠的結(jié)腸癌模型中,抑制FAAH的活性能增加AEA的含量,通過促進(jìn)異常細(xì)胞的凋亡,從而減少了結(jié)腸組織中異常腺窩(早期癌前病變)的形成[13]。Endsley等[14]學(xué)者運(yùn)用組織芯片技術(shù)發(fā)現(xiàn),相對于正常的前列腺組織,前列腺癌組織FAAH的表達(dá)增加了。更為有趣的是,高表達(dá)FAAH蛋白的PC3前列腺癌細(xì)胞2-AG的表達(dá)增加了,增強(qiáng)了PC3細(xì)胞的侵襲和遷移能力;相反的是,通過RNAi技術(shù)敲除LNCaP前列腺癌細(xì)胞的FAAH基因,則抑制了前列腺癌細(xì)胞的侵襲。此外,F(xiàn)AAH的抑制劑CAY10401也能減弱前列腺癌細(xì)胞的侵襲力,并能進(jìn)一步減弱轉(zhuǎn)染了FAAH siRNA的LNCaP細(xì)胞的侵襲能力和遷移活動(dòng)。隨后,Thors研究團(tuán)隊(duì)[15]對412例前列癌患者的石蠟包埋標(biāo)本進(jìn)行免疫組化檢測,發(fā)現(xiàn)FAAH的免疫反應(yīng)性(FAAH-IR)與Gleason評分、樣本中所含腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)、磷酸化的EGFR含量(前列腺癌預(yù)后指標(biāo))和人表皮生長因子受體2含量呈正相關(guān);另外,也發(fā)現(xiàn)281例處于癌癥終末期僅接受姑息治療患者的FAAH-IR與患者的預(yù)后呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān),多變量Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析提示FAAH-IR可作為前列腺癌的預(yù)后指標(biāo)。胰腺癌組織中,低表達(dá)FAAN蛋白的患者的中位生存期為10個(gè)月,而中等表達(dá)和高表達(dá)FAAH蛋白的患者的中位生存期為19.1個(gè)月,這表明FAAH蛋白的表達(dá)水平與患者的預(yù)后有關(guān)[16]。

        本研究的結(jié)果顯示,腦膠質(zhì)瘤組織中無論在基因水平還是在蛋白水平均可檢測到FAAH的表達(dá),F(xiàn)AAH的表達(dá)明顯低于正常腦組織,并且FAAH的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的病理級別呈負(fù)相關(guān)。由此可以推測,F(xiàn)AAH可能參與了腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展過程,檢測FAAH的表達(dá)可評價(jià)腦膠質(zhì)瘤的生物學(xué)行為,為腦膠質(zhì)瘤的臨床治療和預(yù)后判斷提供參考。此外,本研究結(jié)果為內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)抗膠質(zhì)瘤的應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù),F(xiàn)AAH基因可能成為腦膠質(zhì)瘤治療的一個(gè)新藥理學(xué)靶點(diǎn),因?yàn)槟壳耙延醒芯堪l(fā)現(xiàn)FAAH抑制劑AA-5-HT能抑制C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖[8]。

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        Expression of fatty acid amide hydrolase in brain glioma and its significance

        ZHANG Xiaolin,JIANG Feng,GONG Qingyong,et al.

        Department of Neurosurgery,Zhoushan Hospital,Zhoushan 316021,China

        【 Abstract】Objective To investigate the expression of endocannabinoid metabolic enzyme fatty acid amide hydrolase(FAAH)in human brain glioma tissues and its clinicopathological significance. Methods Twenty-three patients with brain glioma,including one case with grade I,7 grade II,5 grade III,2 grade III~I(xiàn)V and 8 glioblastoma,undergoing surgical excision were enrolled in the study;and 8 samples of normal brain tissues from patients undergoing decompression operation due to cerebral hernia served as controls.qRT-PCR and HPLC-MS were used to detect the mRNA and the activity of FAAH,respectively. Results The expression of mRNA and activity of FAAH was significantly higher in low grade(gradeⅠ~Ⅱ)and high grade (gradeⅢ~Ⅳ)brain glioma than those in the normal brain tissues(P<0.01).The expression of FAAH mRNA was positively correlated with the FAAH Activity,and both were negatively correlated with the pathological grades(P<0.01). Conclusion FAAH may be involved in the occurrence and development of brain glioma;the detection of FAAH expression may be of value in evaluation of biological behavior and prognosis of brain glioma.

        Cannabinoid Anandamide FAAH Glioma

        2012-03-14)

        (本文編輯:沈叔洪)

        衛(wèi)生部科學(xué)研究基金-福建省衛(wèi)生教育聯(lián)合攻關(guān)計(jì)劃資助項(xiàng)目(WKJ2008-2-45)

        316021 浙江省舟山醫(yī)院、溫州醫(yī)學(xué)院附屬舟山醫(yī)院神經(jīng)外科(張小林、蔣峰);福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科(龔清永、林志雄);廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系(韓麗君、任杰、傅瑾)

        傅瑾、林志雄,E-mail:lzx1967@sina.com

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