孫校男 郭勇

蛋白質組學在姑息期血瘀證大腸癌中的表達研究

孫校男 郭勇

目的 探討姑息期血瘀證大腸癌血清差異表達的蛋白質及意義。 方法 選取姑息期血瘀證、氣血虧虛證大腸癌患者各6例（血瘀證組、虧虛證組），另擇同期健康平衡體質者6例（對照組），通過雙向凝膠電泳以及質譜鑒定和生物信息學分析，尋找血瘀證組患者血清中特異表達的蛋白質。 結果 血瘀證組出現7種差異表達的蛋白質：在血瘀證及氣血虧虛證中均升高的蛋白質為觸珠蛋白、IL-8、轉移相關蛋白、血管生長因子受體-1，均降低的為血清淀粉樣蛋白A；在血瘀證中高表達而在氣血虧虛證中低表達的是載脂蛋白A-I前體；而在血瘀證中低表達且在氣血虧虛證中高表達的是纖維結合蛋白。 結論 7種差異表達蛋白質的組合性變化可能是姑息期血瘀證大腸癌的物質基礎，具有潛在的診斷、評估預后或指導治療的價值。

大腸癌 瘀血證 血清蛋白 蛋白質組學

大腸癌是最常見的消化道腫瘤之一，在歐美國家其發(fā)病率高居消化道惡性腫瘤的第一位[1]，在我國的發(fā)病率正逐年增高，已成為威脅生命的一個重要危險因素。目前，大腸癌治療提倡在循證醫(yī)學原則指導下多學科綜合的個體化治療，其中中醫(yī)藥治療在改善患者生存質量、提高生存率、對放化療增敏減毒、預防腫瘤復發(fā)和轉移方面均顯示出了較大的潛力[2]。中醫(yī)治療核心為辨證施治，對于相同疾病不同證型治療采用“同病異治”的原則，而證型間差異的本質可能是功能蛋白質的差異。本研究旨在對姑息期血瘀證大腸癌中蛋白質組學的表達進行初步分析，以期發(fā)現特異性蛋白質表達，為臨床治療提供幫助。

1 材料和方法

1.1 血清標本 選取2009-01—2009-06浙江省中醫(yī)院收治的晚期結腸癌患者12例，均經病理診斷確診。血瘀證、氣血虧虛證的診斷依據《現代中醫(yī)臨床診斷學》相關標準[3]，符合3項主要癥狀或2項主要癥狀并有2項次要癥狀。排除以其他合并疾病影響大腸癌證候辨證的患者，排除合并有嚴重的心、肺、腦、肝、腎等臟器疾病的患者，以及神志不清、無法語言交流的患者。其中血瘀證患者6例（血瘀證組），男5例，女1例，年齡45～67（65.83±3.97）歲；腫瘤TNM分期：ⅢB期1例，ⅢC期1例，ⅣA期4例。氣血虧虛證患者6例（氣血虧虛證組），男5例，女1例，年齡47～81（69.83±1.94）歲；腫瘤TNM分期：ⅢB期1例，ⅢC期1例，ⅣA期3例，ⅣB期1例。另擇同期健康平衡體質患者6例（對照組），男3例，女3例，年齡55～75（66.16±8.52）歲。3組患者性別及年齡的差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

1.2 試劑和儀器 丙烯酰胺（Acrlamide）、尿素、Tris-HCL、CHAPS、二硫蘇糖醇（DTT）、十二烷基磺酸鈉（SDS）、Cyder染料（Cy2，Cy3，Cy5）、2-D clean up試劑盒、蛋白定量試劑盒、二甲基甲酰胺（DMF）、固相PH梯度膠條（IPG DryStrip，24cm，pH3～10 NL）均購自GE Healthcare公司，碳酸氫銨、氫氧化銨購自國藥集團，胰蛋白酶購自sigma公司。EttanTM IPGphorTM等電聚焦電泳儀、EttanTM DALTSix垂直板電泳儀、Typhoon 9400多功能熒光掃描成像系統(tǒng)、DeCyder Image QuantTM V6. 5凝膠圖像分析軟件均為GE公司產品。P80MX超速冷凍離心機為日本日立公司產品，基質附助激光解吸飛行時間串聯質譜儀4800（MALDI-TOF-TOF-MS）為美國應用生物系統(tǒng)公司產品。

1.3 方法

1.3.1 血清處理及蛋白質提取 晨間空腹采血，取外周靜脈血3ml于非抗凝的滅菌離心管中，室溫下靜置2h，離心，吸取上清液，保存于-80℃生物冰箱中備用。將各組6份血清等量吸取后混合。經Proteo Extract Albumin/IgG Removal Kit親和柱分別除去白蛋白和球蛋白，收集流出液，取上清液用2-D clean up kit去雜，并用2-D定量試劑盒測定蛋白質濃度后調至統(tǒng)一濃度1.25%，置-80℃保存。

1.3.2 蛋白質熒光標記 將CyDye（Cy2,Cy3,Cy5）加入25μl DMF，離心后取出2μl配成200pmol/μl的工作液，每個混合后樣品各取50μg蛋白質（每組做2塊重復膠），調節(jié)pH值至8.5，加入400pmol相應染料，振蕩混勻，1μl賴氨酸中止反應，冰上避光放置10min，加入2倍體積緩沖液冰浴10min。

1.3.3 雙向電泳 3組蛋白提取物分別用熒光染料Cy3、Cy5標記。3組蛋白提取物等量混合用Cy2標記作為內標。取等量Cy2、Cy3、Cy5標記的樣品混合，用水化液定容至450μl，制成第一向等電聚焦體系。樣品加至pH值3～10的非線性膠條中。等電聚焦的參數：30V 12h；200V 1h；500V 1h；1 000V 1h；8 000V 3h。等電聚集后，將膠條平衡2次（15min/次），IPG膠條轉移進行第二向電泳，電泳參數設定為：30W 45min；100W 6h。至溴酚藍染料遷移至膠的底部邊緣，結束電泳。

1.3.4 圖像掃描分析與質譜分析 熒光標記蛋白經凝膠電泳后在Typhoon9400熒光掃描儀上成像，所用的濾光片和PTM電壓如下：Cy2：Blue2（488）/600；Cy3：Green（530）/680；Cy5：Red（633）/590。 用 DeCyderImage QuantTM V6.5圖像分析軟件進行點識別、背景消除、點匹配及差異蛋白質分析。然后將需要進行鑒定分析的差異蛋白質點切下、脫色、透明、酶解、萃取、脫鹽和吸干，用于質譜分析。將樣品放入質譜儀中進行MALDI-TOF-TOF-MS檢測，得到肽質量指紋圖譜，通過Mascot數據搜索鑒定蛋白質。當匹配分數達到或超過軟件規(guī)定分值時，待測蛋白的氨基酸序列與數據庫中某已知蛋白的氨基酸序列覆蓋率較高，即認為匹配的可能性很大；反之，則認為匹配的可能性較小。

2 結果

雙向電泳后用488、530、633nm的3種波長的激發(fā)光進行掃描膠塊，獲得不同組樣品蛋白質組圖譜（圖1）。選擇血瘀證組與氣血虧虛證組、平衡體質組相比較表達差異超過15%的蛋白質作為差異蛋白質，其圖譜分析見圖2，其中MTA1、VEGFR-1、Haptoglobin的肽指紋圖譜見圖3。血瘀證組差異表達蛋白質點相關信息及質譜鑒定結果見表1，可見血瘀證組出現7種差異表達的蛋白質：在血瘀證及氣血虧虛證中均升高的蛋白質為觸珠蛋白、IL-8、轉移相關蛋白（MTA1）、血管生長因子受體-1（VEGFR-1），均降低的為血清淀粉樣蛋白A（SAA）；在血瘀證中高表達而在氣血虧虛證中低表達的是載脂蛋白A-I前體；而在血瘀證中低表達且在氣血虧虛證中高表達的是纖維結合蛋白。

3 討論

中醫(yī)關于血瘀證的論述，最早出現在《內經》中“惡血”、“凝血”等名?！妒備洝分杏涊d：“瘤之為義，流滯而不去也”，反映了惡性腫瘤與血瘀證之間有非常密切的關系。相關實驗研究也證實了腫瘤浸潤轉移與血液流變學變化呈正相關[4]，且其血液的高凝狀態(tài)隨著隨疾病進展有增高趨勢[5]。本研究結果顯示，血瘀證組及虧虛證組中均升高的為觸珠蛋白、IL-8，均降低的為SAA；在血瘀證組中高表達而在虧虛證組中低表達的是MTA1、載脂蛋白A-I前體、VEGFR-1；而在血瘀證組中低表達且在虧虛證組中高表達的是纖維結合蛋白。

圖1 蛋白質組圖譜（a：平衡體質組，b：血瘀組，c：氣血虧虛證組）

圖2 血瘀組蛋白質組差異分析圖

圖3 蛋白質肽指紋圖譜

表1 蛋白質點相關信息及質譜鑒定結果

MTA1是一個與腫瘤轉移相關、具有組蛋白脫乙?；钚缘幕?，通過改變組蛋白的乙酰化狀態(tài)進而調控基因表達，在信號傳導通路中發(fā)揮一定作用。目前，多項研究證實MTA1與多種惡性腫瘤的預后有關。Higashijima[6]等對74例術后大腸癌患者進行隨訪，發(fā)現免疫組化MTA1陽性組患者5年生存率為50.5%，MTA1陰性組患者5年生存率為73.1%。本研究中血瘀證組及氣血虧虛證組患者均有MTA1的升高，而血瘀證患者的表達高于氣血虧虛證患者，提示血瘀證患者更易出現腫瘤轉移。

血管內皮生長因子屬血小板源性生長因子家族的生長因子，刺激血管內皮細胞的有絲分裂和血管的發(fā)生。其特異性地與相應的VEGFR-1相結合使受體自身磷酸化而激活細胞內信號傳導通路。目前，臨床發(fā)現其與腫瘤的血管形成關系密切，并與抑制腫瘤細胞的凋亡、促進細胞增殖有關[7]。Li等[8]發(fā)現，在肝癌細胞中侵襲力強的細胞VEGFR-1較侵襲力低的細胞表達量高，肝癌組織中其表達也高于癌旁組織。本研究結果亦顯示，血瘀證患者VEGFR-1的表達明顯高于對照組及氣血虧虛，提示預后不佳。

觸珠蛋白是血清α2球蛋白組分中的一種酸性糖蛋白，由2條輕鏈（α鏈）和2條重鏈（β鏈）組成四聚體，其主要功能是與游離血紅蛋白結合將其運至肝中代謝。觸珠蛋白還能促進新生血管的內皮細胞分化和生長，是一種重要的血管生成因子。Sun[9]等采用免疫組化的方法進行研究，發(fā)現在結腸癌肝轉移的患者中觸珠蛋白較無轉移者更高，考慮可能對于結腸癌肝轉移有預示作用。Sarvari等[10]研究發(fā)現，觸珠蛋白α-2鏈在肝癌中較肝硬化中表達更高。本研究結果顯示，觸珠蛋白在血瘀證組及氣血虧虛證組中均升高，且在血瘀證中表達更顯著，提示血瘀證腫瘤患者較氣虛虧虛證患者預后更差。

纖維結合蛋白在抗感染、維持微血管的完整性等方面具有重要作用。纖維連接蛋白的合成減少和（或）降解增加，導致細胞表面結合力下降，使癌細胞脫離原發(fā)部位，在組織間遷徙，形成轉移灶。本研究中血瘀證患者纖維連接蛋白下調提示易發(fā)生腫瘤轉移。血瘀證中存在血液高凝狀態(tài)，導致組織缺氧，酸中毒，而腫瘤是血管依賴性的，因而腫瘤血管生成的因子的大量分泌，促進腫瘤血管供血，提示預后不佳。本研究發(fā)現血瘀證患者MTA1、觸珠蛋白、VEGFR-1與腫瘤血管生長及腫瘤轉移有關的蛋白均高表達，而維持血管完整性的纖維蛋白合成減少提示預后不佳。另外，本研究還發(fā)現其中IL-8、SAA、載脂蛋白A-I前體與炎癥反應有關。

有學者研究發(fā)現，IL-8與肝癌細胞的浸潤性生長或轉移有關[11]。腫瘤細胞的浸潤性生長或轉移可使內皮細胞遭到破壞，導致炎癥反應強烈，刺激機體免疫活性細胞分泌大量IL-8等細胞因子。本研究中血瘀證組IL-8的表達明顯高于其他兩組。汪曉東等[12]發(fā)現，結直腸癌患者SAA水平升高，并發(fā)現隨著腫瘤分期的提高其水平也增高。但在本研究中發(fā)現此蛋白均較對照組下降，具體原因及機制尚不明。血清載脂蛋白Al前體除了在脂質代謝中發(fā)揮核心作用，亦具有抗炎作用，抑制單核巨噬的活化和釋放IL-1β、TNF-α等炎性因子。本研究中血瘀證組患者血清載脂蛋白Al前體高表達，提示機體抑制過劇烈的炎癥反應。

綜上所述，本研究發(fā)現的7種差異表達蛋白質涉及炎癥反應及腫瘤血管生長及腫瘤轉移等方面，這些蛋白質的組合性變化可能是大腸癌血瘀證的物質基礎，具有潛在的診斷、評估預后或指導治療的價值。但本研究發(fā)現的7種蛋白質是大腸癌共有還是血瘀證特有尚需進一步研究證實。

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Proteomics and TCM syndromes in palliative stage of colorectal cancer

SUN Xiaonan，GUO Yong.Affiliated Hangzhou Xixi Hospital

of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053,China

【 Abstract】Objective To investigate differentially expressed serum proteins in palliative stage colorectal cancer patients with blood stasis syndrome and blood/qi deficiency syndrome. Methods Two-dimensional difference gel electrophoresis and mass spectrometry were used to screen the differentially expressed serum proteins among 18 patients with blood stasis syndrome and blood and qi deficiency syndrome;6 healthy subjects with yin-yang harmony served as controls. Results Interleukin-8 and haptoglobin were highly expressed in patients with blood and qi deficiency syndrome and blood stasis syndrome; while serum amyloid A protein precursor(SAA)was decreased in both groups.Metastasis-associated protein,apolipoprotein A-I precursor,vascular endothelial growth factor receptor-1 were highly expressed in blood stasis syndrome group while decreased in patients with blood and qi deficiency syndrome.Fibronectin was decreased in patients with blood stasis syndrome,while highly expressed in patients with blood and qi deficiency syndrome. Conclusion The proteins identified in this study may be related to the development of blood stasis syndrome in patients with colorectal cancer and might be used as molecular targets for diagnosis and treatment of the syndrome.

Colorectal cancer Blood stasis syndrome Serum protein Proteomics

2012-07-13）

（本文編輯：歐陽卿）

浙江省中醫(yī)藥科技計劃重大項目（2007ZA007），浙江省中醫(yī)藥科技計劃一般項目（2011CA031）

310053 杭州，浙江中醫(yī)藥大學附屬杭州市西溪醫(yī)院（孫校男）；浙江中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院（郭勇）