楊勇明 崔健 丁麗君 王建江 阮華娟 方亞平

自噬相關(guān)蛋白Beclin1、MAPLC3在胃癌中的表達及臨床意義

楊勇明 崔健 丁麗君 王建江 阮華娟 方亞平

目的 探討胃癌組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1與微管相關(guān)蛋白輕鏈3（MAPLC3）的表達及其臨床意義。方法 采用免疫組化En-Vision法檢測59例胃癌組織和相應(yīng)的癌旁組織中Beclin1及MAPLC3的表達水平，分析其與多種胃癌臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。結(jié)果 在胃癌組織中Beclin1和MAPLC3的陽性表達率分別為40.7%和44.1%,癌旁組織的陽性表達率分別為100%、93.2%，癌組織明顯低于癌旁組織（P＜0.05）；Beclin1和MAPLC3的表達水平與胃癌的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)（P＜0.05）；胃癌組織中Beclin1和MAPLC3的表達水平呈正相關(guān)（r=0.425，P＜0.05）。結(jié)論 胃癌組織中Beclin1和MAPLC3表達水平均明顯低于癌旁組織，且兩者之間呈正相關(guān)，兩者的低表達可能共同促進胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

胃腫瘤 Beclin1基因 MAPLC3基因

自噬性細胞死亡是一種不同與凋亡、不依賴Caspase的程序性細胞死亡，自噬的抑制與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，已經(jīng)成為目前探討腫瘤發(fā)生和抑制腫瘤生長、克服腫瘤化療耐藥性研究的新熱點。自噬基因Beclin1是一個雙等位腫瘤抑制基因。研究表明[1]，Beclin1下調(diào)明顯增加肝癌、肺癌、胰腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生率。MAPLC3是哺乳動物細胞中酵母ATG8基因的同源物，定位在自噬體膜上，參與自噬體的形成，特異地反映細胞內(nèi)自噬體的數(shù)量，現(xiàn)已作為自噬體的特異性標記蛋白。目前國內(nèi)外有關(guān)Beclin1及MAPLC3的表達對胃腸道腫瘤影響的研究鮮有報道，也未見有關(guān)Beclin1和 MAPLC3表達水平的相互關(guān)系及其與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的相關(guān)研究報道。本研究采用免疫組化法染色，探討B(tài)eclin1和MAPLC3的表達在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程中的作用和可能機制及其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集本院2008-01—2012-12資料完整、手術(shù)切除的胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織（距離癌組織5cm以上，經(jīng)HE染色證實均無癌組織）標本各59例，術(shù)后均經(jīng)病理HE染色證實診斷?；颊咧心?6例,女23例；年齡32～72歲,中位年齡55.3歲。腫瘤位于胃底-賁門10例，胃體15例，胃竇34例；腫瘤＜5cm 49例，≥5cm 10例；TNM分期Ⅰ+Ⅱ期22例，Ⅲ+Ⅳ期37例；高、中分化33例，低、未分化26例?；颊咝g(shù)前均未進行化、放療。

1.2 方法 Beclin1鼠抗人單克隆抗體和免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。采用免疫組化En-Vision法。標本經(jīng)10%甲醛固定、石蠟包埋后4μm厚連續(xù)切片后進行染色。染色步驟按試劑盒要求進行。采用雙盲法隨機選取10個高倍視野（×400），每個高倍視野計數(shù)100個腫瘤細胞。觀察陽性細胞所占的百分數(shù)及染色強度。對陽性細胞所占的百分數(shù)計分，以百分數(shù)＜5%=0、5%～25%=1、26%～50%=2、51%～75%= 3、＞75=4。同時以染色強度無色=0、淡黃色=1、棕黃色= 2、深棕色=3進行評分。最后累積積分＞3分為陽性表達，否則視為陰性表達。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料采用χ2檢驗，等級相關(guān)分析采用Spearman檢驗。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1和MAPLC3在胃癌組織中的表達 Beclin1主要表達于細胞質(zhì)，少量或微量表達于細胞膜，MAPLC3主要表達于細胞質(zhì)。59例胃癌組織標本中Beclin1陽性表達率顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=38.89，P＜0.01）。胃癌組織中MAPLC3陽性表達率顯著低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=30.12，P＜0.01），詳見表1。

表1 Beclin1和MAPLC3在胃組織中的表達[例(%)]

2.2 胃癌組織標本Beclin1和MAPLC3的表達水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 胃癌組織中Beclin1和MAPLC3的表達水平與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度無關(guān)（均P＞0.05）；而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），詳見表2、3。

2.3 Beclin1與MAPLC3兩者表達水平之間的關(guān)系Beclin1陽性表達組中MAPLC3陽性表達率為75.0%（18/ 24），Beclin1陰性表達組中MAPLC3陽性表達率為45.7%（16/35），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Spearman等級相關(guān)分析表明兩者之間呈正相關(guān)（r=0.425，P＜0.05）。

3 討論

自噬是一個發(fā)生在真核細胞中由細胞初級溶酶體處理內(nèi)源性底物的重要生理過程，生命體借此維持蛋白代謝平衡及細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。它既廣泛存在于正常的生理過程中，如細胞廢物清除、結(jié)構(gòu)重建、生長分化等，又是細胞對不良環(huán)境的一種防御機制，如對抗營養(yǎng)缺乏、電離輻射，同時還參與多種疾病的病理過程。

表2 胃癌組織中Beclin1的表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系（例）

Beclin1是酵母ATG6的同系物，也是哺乳動物參與自噬的特異性基因，位于人類染色體17q21上，大約有150ku[2]。Beclin1基因主要通過與ⅢP13K形成復(fù)合體來調(diào)節(jié)其它的ATG蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位，調(diào)節(jié)自噬活性[3]。Beclin1是抑癌基因之一，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。據(jù)報道，40%～75%的人類偶發(fā)性乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌細胞中Beclin1存在單等位基因缺失突變[4]；Beclin1等位基因敲除的小鼠自發(fā)性惡變概率增加，且易受HBV誘導的前惡變性損傷[5]。Beclin1已被認為在調(diào)節(jié)自噬活性參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。國內(nèi)李捷等[6]通過免疫組織芯片、免疫組織化學和Westernblot法檢測胃癌及相應(yīng)癌旁組織發(fā)現(xiàn)癌組織Beclin1低表達（P＜0.05）。本實驗結(jié)果顯示：在59例胃癌組織標本中Beclin1的陽性表達率為40.7%,癌旁組織的陽性表達率為100%，癌組織明顯低于癌旁組織（P＜0.05），提示Beclin1可能參與了胃癌的發(fā)生，也是胃癌發(fā)生的一個早期事件之一。本研究還發(fā)現(xiàn)：Beclin1的低表達與胃癌的臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有密切關(guān)系（P＜0.05），而與患者的年齡、性別、腫瘤的大小、部位、腫瘤細胞的分化程度無明顯相關(guān)（P＞0.05）。在分期較晚、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵及漿膜及漿膜外的胃癌組織中，Beclin1的表達率顯著降低。上述結(jié)果提示，Beclin1在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及浸潤、轉(zhuǎn)移過程中起著重要的作用。

表3 胃癌組織中MAPLC3的表達與胃癌臨床病理特征的關(guān)系（例）

MAPLC3是哺乳動物細胞中酵母 ATG8（Aut7/ Ap98）基因的同源物，定位予前自噬泡膜表面，參與自噬體的形成。MAPLC3有Ⅰ型、Ⅱ型之分。未發(fā)生自噬時，細胞內(nèi)合成的MAPLC3經(jīng)過加工，成為胞質(zhì)可溶性的I型MAPLC3，常規(guī)表達。當自體吞噬發(fā)生時，Ⅰ型MAPLC3經(jīng)泛素樣加工修飾過程，與自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，形成Ⅱ型MAPLC3。MAPLC3結(jié)合并始終位于胞內(nèi)自噬體的膜上，其含量的多少與自噬泡數(shù)量的多少成正比。因此，MAPLC3的表達強度與自噬活性密切相關(guān)，現(xiàn)已作為自噬體的特異性標記蛋白[7]。

對于自噬在不同器官腫瘤，或者同一器官不同類別腫瘤，甚至同一腫瘤的不同發(fā)展階段的表達情況，目前報道結(jié)果不一。國外Othman等[8]通過免疫組織化學檢測67例乳腺癌組織發(fā)現(xiàn)人類LC3兩個亞型LC3A和LC3B在乳腺癌組織中的表達有所差異，其中LC3A在乳腺癌組織中的陽性表達率明顯高于LC3B，并認為LC3A可能在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中扮演更重要的角色。國內(nèi)吳妍等[9]采用免疫組織化學和RT-PCR技術(shù)檢測40例乳腺浸潤性癌和10例乳腺非浸潤性癌時，也驗證了正常乳腺組織乳腺增生性病變?nèi)橄俜墙櫺园┖徒櫺园?組患者中LC3A和LC3B均有不同程度的高表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；且在乳腺癌Ⅰ級、Ⅱ級、Ⅲ級中LC3A表達依次呈遞增趨勢，也認為LC3A可能在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。本實驗結(jié)果顯示：在59例胃癌組織標本中MAPLC3的陽性表達率為44.1%,癌旁組織的陽性表達率分別為93.2%，癌組織明顯低于癌旁組織（P＜0.05）。MAPLC3的低表達與胃癌的臨床病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度有密切關(guān)系（P＜0.05），而與患者的年齡、性別、腫瘤的大小、部位、腫瘤細胞的分化程度無明顯相關(guān)(P＞0.05)。在分期較晚、伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、侵及漿膜及漿膜外的胃癌組織中，MAPLC3的表達率顯著降低。由于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響預(yù)后的獨立因素，因此MAPLC3的低表達常提示預(yù)后較差，并可能與胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，Beclin1陽性表達組中MAPLC3陽性表達率為75.0%（18/24），Beclin1陰性表達組中MAPLC3陽性表達率為45.7%（16/35），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Spearman等級相關(guān)分析表明兩者之間呈正相關(guān)（P＜0.05），提示兩者在胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中起協(xié)同作用，可能在它們的共同低表達作用下，癌細胞的侵襲力及向淋巴管的滲透能力增強，使得癌細胞更容易轉(zhuǎn)移至局部淋巴結(jié)并形成轉(zhuǎn)移灶。因此，研究調(diào)節(jié)Beclin1、MAPLC3的表達將有可能為胃癌的預(yù)防和治療開辟新的途徑。

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Expression of Beclin1 and MAPLC3 in the tissue of gastric cancer and its significance

Objective To investigate the expression of Beclin1 and MAPLC3 in gastric cancer and clinical significance. Methods Immunohistochemical assay was performed to detect the expression of Beclin1 and MAPLC3 in fifty-nine gastric carcinoma tissues and their adjacent noncancerous specimens.Results (1)The expression of Beclin1 and MAPLC3 was both decreased in carcinoma tissues(24/59,40.7%and 26/59,44.1%),which were significantly lower than those in noncancerous tissues (P＜0.05).(2)The expression of both Beclin1 and MAPLC3 was correlated with depth of invasion,lymph node metastasis and TNM classification(P＜0.05).(3)There was positive correlation between the expression of Beclin1 and MAPLC3(r=0.425,P＜0.05). Conclusion The expression of Beclin1 and MAPLC3 both reduced in gastric carcinoma tissues,and the downregulation of Beclin1 is significantly associated with MAPLC3.The co-downregulation of Beclin1 and MAPLC3 may play an important role in lymphatic spread of gastric carcinoma.

Gastric cancerBeclin1 MAPLC3

2013-08-19）

（本文編輯：嚴瑋雯）

311300 臨安市人民醫(yī)院胃腸外科（楊勇明、崔健、丁麗君、王建江），消化內(nèi)科（方亞平），病理科（阮華娟）

王建江，E－mail：yymla@163.com