邵麗娜 何強 余捷凱 王慧萍 陳江華

●論 著

利用磁珠分離聯(lián)合MALDITOFMS技術(shù)判定早期IgA腎病的病理表現(xiàn)

邵麗娜 何強 余捷凱 王慧萍 陳江華

目的 利用尿蛋白質(zhì)組學(xué)的新方法，尋找無創(chuàng)性尿液標(biāo)記物，用以判斷臨床早期IgA腎病的病理表現(xiàn)。方法 對55例早期IgA腎病患者[其中23例病理表現(xiàn)較重（重病理損傷組），32例病理表現(xiàn)較輕（輕病理損傷組）]及14例病理檢查完全正常者（正常對照組）的尿液，利用陽離子磁珠分離技術(shù)聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）分析尿液蛋白質(zhì)質(zhì)譜。結(jié)果 建立了3個尿蛋白質(zhì)/多肽模型。發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物及其診斷模型可以區(qū)分重病理損傷組和輕病理損傷組，其敏感性和特異性分別為90.48%和96.77%。區(qū)分輕病理損傷組和正常對照組的診斷模型，其敏感性和特異性分別為93.55%和85.71%。區(qū)分重病理損傷組和正常對照組的診斷模型，其敏感性和特異性分別為100%和92.86%。 結(jié)論 利用磁珠分離結(jié)合MALDI-TOF-MS的尿蛋白質(zhì)組技術(shù)在判定早期IgA腎病的病理表現(xiàn)顯示出較大潛力。

IgA腎病 磁珠 基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法

IgA腎病是最常見的慢性腎小球腎炎類型[1]，其典型表現(xiàn)為上呼吸道感染后出現(xiàn)發(fā)作性血尿，包括鏡下血尿。IgA腎病可緩慢發(fā)生腎功能損傷，最終發(fā)展為終末期腎病。據(jù)報道，約25%～30%的初診IgA腎病患者20～ 25年后需要腎臟替代治療[2]。高血壓、腎功能損傷和尿蛋白＞1g/d是IgA腎病預(yù)后不佳的獨立預(yù)測因素[3]。臨床早期IgA腎病具有以下特點：患者年輕，腎小球濾過率在正常范圍[eGFR≥60ml/（min·1.73m2）]，輕度蛋白尿(24h蛋白尿＜1g)，血壓正常。然而，近來一些研究發(fā)現(xiàn)上述臨床早期IgA腎病的病理表現(xiàn)往往不輕，有些甚至較重[4-5]。腎穿刺活檢可以診斷早期IgA腎病，但該技術(shù)有創(chuàng)、風(fēng)險較大而且費用較高?；谏鲜鲈颍P者希望尋找一種體液生物標(biāo)記物，用無創(chuàng)的方法來診斷臨床早期IgA腎病不同的病理類型。1999年由Williams[6]首次提出的尿蛋白質(zhì)組學(xué)方法是檢測尿液生物標(biāo)記物的重要方法。已有研究利用尿蛋白質(zhì)組學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)了許多腎臟疾病包括移植腎排斥、腎臟腫瘤、狼瘡腎等的生物標(biāo)記物[7-12]。筆者利用磁珠分離聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）的新技術(shù)，分析了55例早期IgA腎病患者和14例供腎者的尿液，以期發(fā)現(xiàn)部分尿液生物標(biāo)記物，以期判別出病理表現(xiàn)嚴(yán)重的臨床早期IgA腎病。

1 對象和方法

1.1 對象 選擇2008-01—12浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院收治的55例早期IgA腎病患者，其中23例為病理表現(xiàn)較重的患者（重病理損傷組），32例為病理表現(xiàn)較輕的患者（輕病理損傷組）。另擇14例病理檢查完全正常、擬為親屬活體供腎者作為正常對照組。早期IgA腎病定義：（1）血壓＜140/90mmHg，未作降壓治療；（2）eGFR≥60ml/（min·1.73m2）；（3）24h尿蛋白≤1.0g；（4）排除繼發(fā)性IgA腎病，如SLE、糖尿病腎病、乙肝相關(guān)腎和過敏性紫癜性腎炎。由2位病理專家分別進(jìn)行腎臟病變的評估和Lee的標(biāo)準(zhǔn)[13]分級。病理診斷定義：（1）輕微病理表現(xiàn):低于LeeⅢ級；（2）嚴(yán)重病理表現(xiàn)：高于LeeⅣ級，伴或不伴活動性病理改變?nèi)缂?xì)胞性或混合性新月體。所有參與檢驗的患者均簽署知情同意書，并獲得浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院的倫理委員會通過。評估各項臨床指標(biāo)如血清肌酐、尿酸、胱抑素C、尿蛋白與肌酐比值（ACR）。輕病理損傷組和重病理損傷組間一般資料的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），詳見表1。

表1 兩組IgA腎病患者一般資料的比較

1.2 試劑和儀器 德國Bruker Daltonics提供的在線MALDI-TOF-MS（microflex）和AnchorChipTM600-μm MALDI靶標(biāo)和弱陽離子交換磁珠。BD真空采血管SST（Becton Dickinson cat），聚丙烯微量離心管（德國Eppendorf公司），PCR管（荷蘭Biozym公司），F(xiàn)EP（Teflon）瓶（美國Nalgene公司），PP（奧地利Greiner公司），0.1% TFA（HPLC級）、100%丙酮、100%乙醇（HPLC級）、100%氰化甲烷（HPLC級）、10mM醋酸銨、α-氰基-4-羥基肉桂酸（HCCA）（美國Sigma公司），肽校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)（德國Bruker Daltonics公司），蛋白校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)Ⅰ（德國Bruker Daltonics公司），準(zhǔn)備MALDI-TOF-MS的磁珠分離樣品（德國Bruker Daltonics公司）。

1.3 方法 患者在經(jīng)皮腎穿刺活檢前、供腎者在取腎前留取10ml尿液，2h內(nèi)室溫下以10 000g/min離心10min，凍存于-70℃。檢測前尿樣室溫凍融30min。將WCX磁珠搖勻。加入10μl緩沖液至200μl的檢測管中，再加入10μl的磁珠，混勻，避免氣泡。加入5μl的尿樣，混勻，避免氣泡。經(jīng)過徹底攪拌，室溫下孵育5min，將試管置于磁珠分離裝置1min，使得磁珠和液體徹底分離。小心移去上清液，加入100μl磁珠清潔緩沖液。將試管在分離器中重復(fù)移除至少10次，靜置3 min，再小心移除上清液，重復(fù)2次。加入5μl的磁珠洗脫緩沖液，徹底搖勻后置入分離裝置2min，然后將上清液轉(zhuǎn)移至干凈的0.5ml試管內(nèi)，加入5μl的磁珠穩(wěn)定緩沖液。從0.5ml的干凈試管中吸取1μl液體到AnchorChipTM600-μm MALDI靶標(biāo)上，室溫下自然干燥。最后，采用MALDITOF-MS分析AnchorChipTM600-μm MALDI靶標(biāo)上的蛋白質(zhì)和多肽。

1.4 數(shù)據(jù)分析 所有的實驗數(shù)據(jù)由俞捷凱設(shè)計的浙江大學(xué)蛋白芯片數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)處理和建立模型。第一步：用非抽樣離散小波轉(zhuǎn)換方法對原始數(shù)據(jù)并進(jìn)行信號降噪處理。第二步：根據(jù)標(biāo)記好的出現(xiàn)在所有選定光譜中的3個峰值，調(diào)整了信號的強度標(biāo)記。通過對齊單調(diào)的最小曲線和質(zhì)量校正的方法對光譜進(jìn)行基線校正。利用一種特殊方法進(jìn)行蛋白峰值的檢測和定量，該方法可以顧及每個降噪、基線校正和校準(zhǔn)質(zhì)譜。第三步：過濾掉信噪比（S/N）＞3的峰值。第四步：將各個樣本中m/z差異＜0.3%的峰值聚為一類。將聚類后只出現(xiàn)在＜10%樣本中的峰值去掉。對找出的峰值在各個樣本中的強度作均一化處理。集內(nèi)最大高度作為峰值，代表其表達(dá)強度。

1.5 數(shù)據(jù)建立模型 使用非線性支持向量機（support vector machine，SVM）分類器來區(qū)分不同的組。支持向量機采用徑向基核函數(shù)，Gamma值設(shè)為0.6，罰分函數(shù)（C）設(shè)為19。通過留一交叉驗證的方法評估和驗證診斷模型。特征向量的選取采用統(tǒng)計過濾結(jié)合模型依賴性篩選的方法。對每個質(zhì)荷比峰值行Wilconxon秩和檢驗，選出P值最小的10個峰值進(jìn)一步分析。將10個峰值的任意組合用于支持向量機模型的輸入，用留一交叉驗證法評估模型的預(yù)測效果，選出建立支持向量機模型預(yù)測的約登指數(shù)最高的組合作為最終的候選標(biāo)志物，建立的模型和留一法交叉驗證的結(jié)果作為最終的結(jié)果。采用SPSS15.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 輕病理損傷組和重病理損傷組診斷模型的比較 共檢測到21個有意義的蛋白峰值，其中10個作為診斷模型的生物標(biāo)記物，其敏感性90.48%，特異性96.77%，潛在的蛋白生物標(biāo)記的質(zhì)荷比為2 740、3 086、2 747、3 032、2 095、3 328、6 174和2 754，這些潛在的蛋白生物標(biāo)記在重病理損傷組中表達(dá)上調(diào)，而其余兩個質(zhì)荷比為3 235和6 189的蛋白生物標(biāo)記在輕病理損傷組表達(dá)上調(diào)，詳見圖1、表2。

圖1 診斷模型1 SVM結(jié)果散點圖

2.2 輕病理損傷組和正常對照組的診斷模型的比較 共檢測到50個蛋白峰值，其中選取10個作為診斷模型的生物標(biāo)記物，其敏感性93.55%，特異性85.71%。3個質(zhì)荷比為6 190、3 437和3 211的蛋白生物標(biāo)記在輕病理損傷組表達(dá)上調(diào)。而其余質(zhì)荷比為2 088、3 972、2 176、2 386、1 434、5 218和3 876的蛋白生物標(biāo)記在正常對照組上調(diào)，詳見圖2、表3。

2.3 重病理損傷組和正常對照組的診斷模型的比較 共檢測到50個蛋白峰值，其中選取20個作為診斷模型的生物標(biāo)記物，其敏感性100%，特異性92.86%。質(zhì)荷比為2 712的蛋白生物標(biāo)記在重病理損傷組表達(dá)上調(diào)，其余蛋白生物標(biāo)記在正常對照組表達(dá)上調(diào)，詳見圖3、表4。

表2 作為診斷模型的10個尿液生物標(biāo)記在各組的表達(dá)強度

圖2 診斷模型2 SVM結(jié)果散點圖

表3 作為診斷模型的10個尿液生物標(biāo)記在各組的表達(dá)強度

3 討論

臨床早期的IgA腎病并不意味著預(yù)后良好。Szeto等[14]發(fā)現(xiàn)早期IgA腎病有時會進(jìn)一步發(fā)展。中期患者隨訪7年后，44%的患者出現(xiàn)了嚴(yán)重事件。另外，一些早期IgA腎病往往伴隨嚴(yán)重的病理改變，如LeeⅣ級以及出現(xiàn)細(xì)胞性新月體。腎穿刺由于風(fēng)險較高，在許多基層醫(yī)院無法常規(guī)開展。因此，尋找無創(chuàng)的方法來鑒別臨床早期IgA腎病的病理表現(xiàn)成為研究熱點。異常的尿液往往可以反映腎臟的病變，因此檢測尿液的生物標(biāo)記物成為各個研究的關(guān)注點[15-19]。然而，尿液中的成分多種多樣，組多數(shù)生物標(biāo)記物往往是小分子蛋白甚至多肽，常規(guī)的檢測方法如蛋白電泳均無法檢測和鑒定。先進(jìn)的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以進(jìn)行大量的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[15]。MALDI-TOF-MS聯(lián)合磁珠是其中一種重要的技術(shù)方法。通過標(biāo)準(zhǔn)化的多肽組剖析，該方法可以在許多領(lǐng)域?qū)w液進(jìn)行高效分析[20-21]。本研究采用此方法來鑒定臨床早期IgA腎病尿液的生物標(biāo)記物以及診斷模型。在尿液蛋白多肽譜中，檢測出許多有意義的蛋白峰值，通過浙江大學(xué)蛋白芯片數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)的處理，利用這些鑒定出來的蛋白峰值建立診斷模型，并顯示有較高的敏感性和特異性。

圖3 診斷模型3 SVM結(jié)果散點圖

表4 作為診斷模型的20個尿液生物標(biāo)記在各組的表達(dá)強度

MALDI-TOF-MS聯(lián)合磁珠已經(jīng)成為一種重要的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在許多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。Cheng等[7]鑒定纖維蛋白α鏈片段是口腔癌的血漿腫瘤標(biāo)記，其敏感性為100%，特異性為97%。Huang等[20]報道稱，該方法作為一種潛在有效的方法可以描繪血清蛋白質(zhì)組，再結(jié)合模式分析，可以建立一個包含4個生物標(biāo)記的診斷模型用于快速準(zhǔn)確地區(qū)分SLE、RA、SS和健康對照者。因此，MALDI-TOF-MS聯(lián)合磁珠方法可以區(qū)分患者和健康者。

目前已有一些利用尿蛋白質(zhì)組學(xué)研究IgA腎病的研究。Park等[19]利用2-DE和MALDI-TOF-MS首次對IgA腎病進(jìn)行尿液蛋白質(zhì)圖譜的描繪。Haubitz[22]報道：利用CE-MS可以鑒別IgA腎病和健康人群、膜性腎病患者，并且具有較高的敏感性和特異性。Yokota等[23]利用2D-DIGE-MS發(fā)現(xiàn)α1-微球蛋白可以作為IgA腎病的生物標(biāo)記物。盡管各自的研究成果都有顯著的意義，但是上述各種蛋白質(zhì)組學(xué)方法均不能發(fā)現(xiàn)低分子蛋白和多肽，而這些往往有可能就是遺漏的生物標(biāo)記物。本研究選擇弱陽離子交換磁珠作為蛋白質(zhì)組學(xué)的分餾工具。該類磁珠具有強大的陰離子交換能力、疏水正相以及反相、固定的捕獲金屬的親和力。WCX磁珠可以在尿液中捕獲更多的蛋白，尤其是低分子量的蛋白。

筆者利用磁珠結(jié)合蛋白聯(lián)合MALDI-TOF-MS檢測出很多低分子蛋白以及多肽，并建立了早期IgA腎病病理表現(xiàn)重的診斷模型。在模型1中，從輕病理損傷組中鑒定出重病理損傷組的敏感性為90.48%，特異性為96.77%。在模型2中，從正常對照組中鑒定出輕病理損傷組的敏感性為93.55%，特異性為85.71%。在模型3中，從正常對照組中鑒定出輕病理損傷組的敏感性為100%，特異性為92.86%。因此，筆者認(rèn)為確定這些蛋白質(zhì)或肽的生物標(biāo)志物在IgA腎病的診斷和鑒別診斷中顯得尤為重要。

本研究首次使用經(jīng)過病理檢測正常，擬為活體供腎者的尿液標(biāo)本作為對照組，意味著在尿液蛋白組學(xué)的研究中是真正的健康對照組，結(jié)果更可靠。但樣本量少，未來需要更多早期IgA腎病患者進(jìn)一步驗證本研究的模型。

綜上所述，利用MALDI-TOF-MS聯(lián)合磁珠技術(shù)，可以尋找到潛在的分子標(biāo)志物，通過模式分析，建立了早期IgA腎病不同病理類型的3個診斷模型，可以準(zhǔn)確地鑒別病理表現(xiàn)較重和較輕的患者。進(jìn)一步的研究將著眼于這些潛在的蛋白在早期IgA腎病的發(fā)病機制的參與。MALDI-TOF-MS聯(lián)合磁珠技術(shù)作為一種高效的蛋白質(zhì)組學(xué)的方法可以在尿蛋白質(zhì)組研究領(lǐng)域得到更廣的應(yīng)用。

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Identification of the pathologic presentation of clinical early IgA nephropathy by MALDI-TOF-MS with magnetic beads

Objective To search noninvasive methods to identify the pathologic presentation of early IgA nephropathy through urinary proteomic analysis.Methods Total 55 patients with IgA nephropathy were included in this study,with 23 patients having severe pathologic presentation,and the other 32 having mild ones.The control group included 14 normal subjects.The urinary proteomic spectra from those three groups were generated by Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS)with weak cationic exchange magnetic beads. Results Three Urine protein/peptide spectra patterns were established.In pattern one,the potential protein biomarkers could identify the severe group and the mild group,the sensitivity was 90.48%and the specificity was 96.77%.In pattern two,the potential protein biomarkers could identify the mild group and the normal group,the sensitivity was 93.55%and the specificity was 85.71%.In pattern three,The potential protein biomarker could identify the severe group and the normal group,the sensitivity was 100%and the specificity was 92.86%. Conclusion Using MALDI-TOF-MS with magnetic beads to detect urine proteomic patterns shows great potential in identifying early IgA nephropathy with different pathological manifestations.

IgA nephropathy Magnetic beads Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry

2013-08-30）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

310003 杭州，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎臟病中心（邵麗娜、何強、王慧萍、陳江華）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院腫瘤研究中心（余捷凱）

陳江華，E-mail:chenjianghua@zju.edu.cn