徐微娜，于樹鵬，辛 軍，郭啟勇

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，遼寧 沈陽 110004）

判斷抗腫瘤治療效果的傳統(tǒng)方法是檢測治療所引起的腫瘤大小的變化，一般需要較長時間（平均為幾個月），對于一些難治性腫瘤，早期評價治療反應(yīng)可以在腫瘤大小改變之前調(diào)整治療方案，避免不必要的毒性及經(jīng)濟上的浪費。

惡性腫瘤一個重要的生物學(xué)特征是腫瘤細(xì)胞的增殖活性，因此腫瘤細(xì)胞增殖活性檢測評價腫瘤細(xì)胞對治療的反應(yīng)具有重要的意義[1]。隨著PET-CT在臨床應(yīng)用的開展，應(yīng)用正電子藥物對腫瘤治療效果（尤其是治療后早期療效）進(jìn)行評價成為可能。目前臨床應(yīng)用最為廣泛的正電子顯像劑是18F-FDG，但由于其反映的僅是葡萄糖代謝水平，特異性較差。18F-FLT作為嘧啶類似物在臨床前及臨床研究中初步得出了一些結(jié)果[2-7]，但是其作用機理及對腫瘤的診斷意義還沒有完全清楚，對于不同腫瘤及不同治療方式所得到的結(jié)果也不盡相同[8]，還需要更多的研究來探索18F-FLT在腫瘤診斷及療效評價中的價值。

本實驗將對比研究放療后早期腫瘤18F-FLT及18F-FDG攝取的變化及其與腫瘤細(xì)胞增殖活性之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑與儀器

Wistar大鼠，雌性，體質(zhì)量（120±20）g，清潔級，購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。荷Walker 256腹水瘤Wistar大鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所，清潔級。示蹤劑18F－FLT由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院PET-CT中心合成，F(xiàn)LT前體由常熟華益化工有限公司生產(chǎn)。示蹤劑18F－FDG由中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院PET-CT中心合成，F(xiàn)DG前體由常熟華益化工有限公司生產(chǎn)。放療儀器：西門子公司PRIMS-M放療儀。正電子藥物合成系統(tǒng)：GE公司Minitrace藥物合成系統(tǒng)。PET-CT：GE公司Discovery ST16 PET-CT。增值細(xì)胞核抗原（Ki－67）免疫組化試劑盒購于武漢博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 荷Walker 256腫瘤大鼠模型的制備

細(xì)胞懸液的制備：將荷Walker 256腫瘤大鼠飼養(yǎng)至腹部彭隆，從腹水型Walker 256瘤株大鼠腹腔中抽取淡黃色腹水5~6mL，用生理鹽水稀釋成4×107mL-1細(xì)胞懸液備用。用注射器于大鼠右前腋部皮下接種Walker 256細(xì)胞，0.2 mL/只，7~10 d成瘤。當(dāng)接種部位腫瘤最大徑長至1.5~2.0 cm左右進(jìn)行實驗。

1.2.2 動物分組及處理

30只 Wistar大鼠隨機分為正常對照組（10只）、放療后24 h組（10只）、放療后48 h組（10只）。放療：腹腔注射水合氯醛（3 mL/kg體質(zhì)量），麻醉后進(jìn)行放療。放射劑量：10 Gy，單次照射，放射野為左側(cè)腋下腫物。10只于放療后24 h分別行18F-FLT及18F-FDG PET-CT顯像（各5只），10只于放療后48 h分別行18F-FLT及18F-FDG PET-CT顯像 （各5只）。對照組：不進(jìn)行任何治療，分別行18F-FLT及18F-FDG PET-CT顯像（各5只）。

1.2.318F-FLT及18F-FDG PET-CT顯像及圖像處理

各組Wistar大鼠尾靜脈分別注射18F-FLT及18F-FDG 0.5 mCi，0.2 mL（18.5 MBq/0.2 mL），注射前后分別測定注射器放射性活度。注射顯像劑后40min腹腔注射水合氯醛（3 mL/kg）進(jìn)行麻醉，注射顯像劑后1 h行PET-CT顯像。大鼠麻醉后俯臥于泡沫固定板，置于PET-CT成像系統(tǒng)內(nèi)（GE公司Discovery ST16 PET-CT），CT采集條件：120 kV，60 mA，層厚5 mm；PET采用3D采集模式，3 min/床位，掃描范圍從頭頂至尾部。圖像后處理系統(tǒng)為GE公司Xeleris工作站。數(shù)據(jù)處理：將采集的數(shù)據(jù)在Xeleris工作站進(jìn)行圖像斷層、融合，定量測定腫瘤部位ROI內(nèi)放射性計數(shù)與對側(cè)相同部位軟組織相同面積ROI內(nèi)放射性計數(shù)比值（T/NT）。

1.2.4 腫瘤組織處理

顯像后即刻脫臼處死大鼠，稱重后剝離腫瘤組織，生理鹽水沖洗擦干后測定腫瘤放射性活度及重量，計算每克腫瘤組織攝取放射性百分比（%ID/g）。然后放入10%的中性甲醛緩沖液固定后24 h內(nèi)石蠟包埋，制成切片及HE染色。免疫組化測定：將制成的石蠟切片經(jīng)過脫蠟和水化、抗原修復(fù)、滴加Ⅰ抗和滴加Ⅱ抗后，DAB顯色，以及蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封片后進(jìn)行光鏡下觀察Ki－67的表達(dá)情況。涂片及切片觀察方法：Ki-67基因蛋白以細(xì)胞核呈棕黃色或細(xì)胞漿同時呈棕黃色為陽性，單純細(xì)胞漿著色而細(xì)胞核無著色或二者均無著色為陰性。采用OLYMPUS顯微鏡在高倍鏡（400倍）下隨機觀察10個視野，計算陽性細(xì)胞所占百分比，陽性細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)即表示指標(biāo)的指數(shù)（Labelling index，LI）。所有計數(shù)由同一人操作。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)處理使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件，以P< 0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01為差異顯著。計量資料數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，放療前后各組數(shù)據(jù)比較采用Mann-Whitney檢驗，相關(guān)性比較采用Spearman相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 PET-CT顯像結(jié)果

放療后24 h及48 h的PET-CT顯像結(jié)果顯示大鼠腫瘤部位18F-FLT放射性分布較對照組降低（圖1a~1c），T/NT比值較對照組降低 （P<0.01，表1）；放療后24 h大鼠腫瘤部位18F-FDG放射性分布較對照組下降不明顯 （圖2a，2b），T/NT比值較對照組下降不明顯（P>0.05，表1）；放療后48 h大鼠腫瘤部位18F-FDG放射性分布較對照組略降低 （圖2a~ 2c），T/NT比值較對照組略降低（P>0.05，表1）。

2.2 腫瘤組織Ki-67檢測結(jié)果

細(xì)胞核染成褐色為增殖腫瘤細(xì)胞，與對照組（58.92±4.85）%相比，LI-Ki-67放療后24 h、48 h均明顯降低（P<0.001）（表1，圖3a~3c）。

2.3 腫瘤18F-FLT、18F-FDG攝取與LI-Ki-67相關(guān)性

放療后18F-FLT攝?。═/NT）與LI-Ki-67呈正相關(guān)（r=0.899）；放療后18F-FDG攝?。═/NT）與LIKi-67無正相關(guān)（r=0.379）。18F-FLT組及18F-FDG組 T/NT與%ID/g之間有良好的相關(guān)性（r分別為0.807和0.813）。

3 討論

在本研究中，荷Walker 256腫瘤的大鼠應(yīng)用單劑量的放射治療（10 Gy）進(jìn)行治療，對比了治療前及治療后早期18F-FDG和18F-FLT攝取的變化及其與腫瘤細(xì)胞增殖的相關(guān)性。結(jié)果表明，Walker 256腫瘤在單劑量（10 Gy）放療后早期（24 h）18F-FLT攝取降低，48 h降低更加明顯，同時免疫組化檢測到腫瘤組織Ki-67也出現(xiàn)了相應(yīng)的下降。

圖1 a 對照組，腫瘤18F-FLT放射性分布高于周圍本底。 圖1b 放療后24 h，腫瘤18F-FLT放射性分布較對照組降低。 圖1c 放療后48h，腫瘤18F-FLT放射性分布較對照組進(jìn)一步降低。 圖2a 對照組，腫瘤18F-FDG放射性分布明顯高于周圍本底。 圖2b 放療后24 h，腫瘤18F-FDG放射性分布較對照組無明顯變化。 圖2c 放療后48 h，腫瘤18F-FDG放射性分布較對照組略降低。 圖3a 對照組，可見大量的增殖細(xì)胞。 圖3b 放療后24 h，增殖細(xì)胞比例較對照組降低。 圖3c 放療后48 h，增殖細(xì)胞比例較對照組進(jìn)一步降低。Figure 1a. Control group,the distribution of18F-FLT in tumor was higher than background. Figure 1b. 24 h after radiotherapy,the distribution of18F-FLT in tumor decreased than the control group. Figure 1c. 48 h after radiotherapy,the distribution of18F-FLT in tumor decreased further. Figure 2a. Control group,the distribution of18F-FDG in tumor was much higher than background. Figure 2b. 24 h after radiotherapy,the distribution of18F-FDG in tumor was similar to the control group. Figure 2c. 48 h after radiotherapy,the distribution of18F-FDG in tumor decreased slightly than the control group. Figure 3a. Control group,there were a lot of proliferative cells. Figure 3b. 24 h after radiotherapy,the proportion of proliferative cells decreased than the control group. Figure 3c. 48 h after radiotherapy,the proportion of proliferative cells decreased further.

表1 放療后腫瘤組織18F-FLT、18F-FDG攝取及Ki-67結(jié)果

放療劑量的選擇：Rasey等[4]應(yīng)用18F-FLT-PET對腫瘤放療反應(yīng)的研究表明，單次放療劑量在5 Gy及以上，18F-FLT可敏感檢測出放療所引起的變化，單劑量大于10 Gy的放療可引起18F-FLT攝取的明顯變化。本研究所選劑量為單次10 Gy，結(jié)果表明放療后24 h及48 h的18F-FLT攝取較對照組明顯降低，這與Molthoff等[9]及Kubota等[10]的研究結(jié)果類似。18F-FDG組與18F-FLT組腫瘤大小均無明顯變化，腫瘤細(xì)胞變化一致，表明18F-FDG與18F-FLT攝取的變化與腫瘤形態(tài)改變無關(guān)。

放射治療由于抑制了細(xì)胞的DNA合成，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞利用胸腺嘧啶脫氧核苷的量減少，因而其攝取胸腺嘧啶脫氧核苷類似物18F-FLT的量降低。18FFLT作為嘧啶類似物在細(xì)胞增殖過程中能夠摻入DNA，但不摻入RNA。18F-FLT通過被動擴散和Na+依賴載體的易化轉(zhuǎn)運進(jìn)入細(xì)胞，隨后，在胸腺嘧啶核苷激酶1（TK1）的作用下發(fā)生磷酸化生成18F-FLT-一磷酸鹽而滯留在細(xì)胞內(nèi)。TK1是DNA補救合成途徑中的一種重要的酶，在靜止細(xì)胞中無活性，但在增殖細(xì)胞的G1期后期和S期該酶活性達(dá)到最大[11]。因此，18F-FLT通過TK1催化發(fā)生磷酸化形成了其作為增殖示蹤劑的基礎(chǔ)。文獻(xiàn)報道TK1在惡性腫瘤細(xì)胞中的活性比在良性細(xì)胞中高3~4倍[12]，而且腫瘤細(xì)胞TK1羧基末端發(fā)生突變，使其在M期不能正常降解失活，最終導(dǎo)致TK1在腫瘤細(xì)胞中的活性異常增高[13]。因此，增殖活躍的腫瘤可以攝取18F-FLT而在PET-CT上表現(xiàn)為局部放射性濃聚。由此可見，Walker 256腫瘤在放療后攝取18F-FLT降低很大可能與細(xì)胞增殖活性受抑有關(guān)，18F-FLT攝取的量的多少可以反映放療后早期腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)。

放療后24 h腫瘤組織18F-FDG攝取較對照組輕度增高，原因可能在于放療后早期可以引起糖酵解異常而引發(fā)局部炎癥反應(yīng)導(dǎo)致糖代謝增高[14-15]，而18F-FDG反映的是整個腫瘤組織中所有存活細(xì)胞（包括腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和炎性細(xì)胞）的代謝過程而不單是腫瘤細(xì)胞，從而使18F-FDG攝取增加。這與Hautzel等[16]研究的結(jié)果18F-FDG在放療后早期攝取增高相一致。因此18F-FDG不能夠反應(yīng)放療后早期腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)，不適于評價腫瘤放療早期療效。而18F-FLT不受放療引起的糖酵解變化及局部炎癥反應(yīng)的影響，可以真實地反應(yīng)放療后早期細(xì)胞的增殖狀況，是評價放療后早期反應(yīng)的顯像劑。

本研究選用Ki-67來作為細(xì)胞增殖的金標(biāo)準(zhǔn)，因其是比較公認(rèn)的反映腫瘤組織增殖活性的指標(biāo)。Ki-67是Gerdes等發(fā)現(xiàn)在增殖細(xì)胞中表達(dá)的一種核抗原，被認(rèn)為是人類所有增殖細(xì)胞核中普遍存在的標(biāo)志性抗原，除G0期外，Ki-67在細(xì)胞周期各期中均有表達(dá)，在有絲分裂周期中S期的后半段上升，于G2和M期達(dá)到峰值。Ki-67半衰期短，脫離細(xì)胞周期后迅速降解，檢測結(jié)果的可靠性明顯優(yōu)于半衰期長的增殖細(xì)胞核抗原。作為在核中表達(dá)的雙分子蛋白，Ki-67被廣泛地應(yīng)用于測定各種腫瘤的增殖活性。近年來文獻(xiàn)報道多種腫瘤中均存在Ki-67過度表達(dá)。因此，推測Ki-67可能是一種原癌基因，其過度表達(dá)可導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。

同時本文比較了PET-CT顯像測定腫瘤攝取T/NT與腫瘤組織實際攝取%ID/g的相關(guān)性，結(jié)果他們之間呈良好的正相關(guān)，表明通過顯像所得的T/NT可以真實地反映腫瘤組織的實際攝取，為體外無創(chuàng)檢測腫瘤細(xì)胞的增殖提供依據(jù)。

總之，放療后早期，18F-FLT攝取與腫瘤細(xì)胞增殖活性呈正相關(guān)，即18F-FLT可以反映腫瘤治療后早期的細(xì)胞反應(yīng)。而18F-FDG攝取與腫瘤放療后早期增殖反應(yīng)無相關(guān)，腫瘤增殖僅是18F-FDG攝取的一個影響因素，還有其他影響因素影響18F-FDG的攝?。ㄈ玳g質(zhì)細(xì)胞的活性、炎性反應(yīng)等）。18F-FLT具有較高的腫瘤特異性，是評價腫瘤放射治療后早期反應(yīng)的靈敏的正電子顯像劑。

[1]Colozza M,Azambuja E,Cardoso F,et al.Proliferative markers as prognostic and predictive tools in early breast cancer:where are we now?[J].Ann Oncol,2005,16(11):1723-1739.

[2]Shields AF,Grierson JR,Dohmen BM,et al.Imaging proliferation in vivo with[F-18]FLT and positron emission tomography[J]. Nat Med,1998,4(11):1334-1336.

[3]Grierson JR,Shields AF.Radiosynthesis of 3’-deoxy-3’-[(18)F] fluorothymidine:[(18)F]FLT for imaging of cellular proliferation in vivo[J].Nucl Med Biol,2000,27(2):143-156.

[4]Rasey JS,Grierson JR,Wiens LW,et al.Validation of FLT uptake as a measure of thymidine kinase-1 activity in A549 carcinoma cells[J].J Nucl Med,2002,43(9):1210-1217.

[5]Buck AK,Halter G,Schirrmeister H,et al.Imaging proliferation in lung tumors with PET:18F-FLT versus18F-FDG[J].J Nucl Med,2003,44(9):1426-1431.

[6]Mier W,Haberkorn U,Eisenhut M.[18F]FLT;portrait of a proliferation marker[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2002,29(2): 165-169.

[7]Shields AF.Positron emission tomography measurement of tumor metabolism and growth:its expanding role in oncology[J].Mol Imaging Biol,2006,8(3):141-150.

[8]Yamamoto Y,Nishiyama Y,Ishikawa S,et al.Correlation of18FFLT and18F-FDG uptake on PET with Ki-67 immunohistochemistry in non-small cell lung cancer[J].Eur J Nucl Med Mol Imaging,2007,34(10):1610-1616.

[9]Molthoff CF,Klabbers BM,Berkhof J,et al.Monitoring response to radiotherapy in human squamous cell cancer bearing nude mice:comparison of 2’-deoxy-2’-[18F]fluoro-D-glucose(FDG)and 3’-[18F]fluoro-3’-deoxythymidine(FLT)[J].Mol Imaging Biol,2007, 9(6):340-347.

[10]Kubota K,Ishiwata K,Kubota R,et al.Tracer feasibility for monitoring tumor radiotherapy:a quadruple tracer study with fluorine-18-fluorodeoxyglucose or fluorine-18-fluorodeoxyuridine, L-[methyl-14C]methionine, [6-3H]thymidine,and gallium-67[J]. J Nucl Med,1991,32(11):2118-2123.

[11]Munch-Petersen B,Cloos L,Jensen HK,et al.Human thymidine kinase 1.Regulation in normal and malignant cells[J].Adv Enzyme Regul,1995,35:69-89.

[12]Boothman DA,Davis TW,Sahijdak WM.Enhanced expression of thymidine kinase in human cells following ionizing radiation [J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,1994,30(2):391-398.

[13]Kauffman MG,Kelly TJ.Cell cycle regulation of thymidine kinase:residues near the carboxyl terminus are essential for the specific degradation of the enzyme at mitosis[J].Mol Cell Biol, 1991,11(5):2538-2546.

[14]Schoder H,Gonen M.Screening for cancer with PET and PET/ CT:potential and limitations[J].J Nucl Med,2007,48(Suppl 1): 4S-18S.

[15]Cook GJ,Maisey MN,Fogelman I.Normal variants,artefacts and interpretative pitfalls in PET imaging with 18-fluoro-2-deoxyglucose and carbon-11 methionine[J].Eur J Nucl Med,1999, 26(10):1363-1378.

[16]Hautzel H,Müller-Gartner HW.Early changes in fluorine-18-FDG uptake during radiotherapy[J].J Nucl Med,1997,38(9): 1384-1386.