王辰月　陳秀蓉　楊成德

摘要：從分離的31株洽草內(nèi)生細(xì)菌中篩選出3株具有較強(qiáng)的IAA分泌功能的內(nèi)生細(xì)菌QS3，QG3和QS15，用其稀釋過(guò)的培養(yǎng)液對(duì)苜蓿、紅三葉、燕麥、黑麥草浸種，測(cè)定了供試牧草種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、胚根長(zhǎng)度等指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)種子的發(fā)芽勢(shì)及發(fā)芽率平均提高了5%～15%，胚根長(zhǎng)度較對(duì)照也均增加，且差異顯著（P<0.05）。

關(guān)鍵詞：內(nèi)生細(xì)菌；分泌吲哚乙酸；發(fā)芽

中圖分類號(hào)：Q 936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：10095500（2013）01002104

目前，植物內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)作用主要分為兩方面：一方面，植物內(nèi)生細(xì)菌可通過(guò)產(chǎn)生植物生長(zhǎng)物質(zhì)（植物生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞激動(dòng)素等）促進(jìn)植物生長(zhǎng)；另一方面，植物內(nèi)生細(xì)菌也可通過(guò)自身的固氮、溶磷以及對(duì)不同植物病原菌的拮抗作用或者通過(guò)增強(qiáng)植物對(duì)礦物質(zhì)利用的有效性間接的促進(jìn)植物生長(zhǎng)＼[1-5＼]。研究結(jié)果顯示，內(nèi)生細(xì)菌在增加植株株高、干重、提高根莖重量以及增強(qiáng)植株生長(zhǎng)勢(shì)等方面均有明顯的促進(jìn)作用。有研究者分別從油菜的根和莖中進(jìn)行了內(nèi)生細(xì)菌的分離工作，并用其中7株分離物的菌懸液處理油菜和番茄的種子，發(fā)現(xiàn)供試菌株能不同程度地提高油菜和番茄種子的萌發(fā)速度、增加幼苗的長(zhǎng)度＼[6＼]。何紅等＼[7＼]在研究BS1和BS2菌株對(duì)辣椒和白菜的促生作用機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，用菌株培養(yǎng)液浸種后，可使植株體內(nèi)生長(zhǎng)素（IAA）、赤霉素（GA3）等植物內(nèi)源激素含量增加，脫落酸（ABA）含量減少。因此，篩選具有IAA分泌能力的植物內(nèi)生細(xì)菌，為開(kāi)發(fā)利用高寒草地植物內(nèi)生細(xì)菌資源，以及進(jìn)一步研發(fā)生物菌肥等提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 供試31株內(nèi)生細(xì)菌均分離自東祁連山高寒草地優(yōu)勢(shì)禾本科洽草（Koeleria cristata）。

1.1.2 儀器及試劑 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)、S2000型分光光度計(jì)、IOC402.XXI.C型控溫振蕩器、各種微量移液器（Biometra公司）。

PC比色液：稱取12 g FeCl3溶于300 mL蒸餾水，緩慢加入429.7 mL 98%的H2SO4，冷卻后將溶液定容至1 L，該比色液測(cè)定值為0.3～20 μg/mL。

S2比色液：稱取4.5 g FeCl3溶于300 mL蒸餾水，緩慢加入587.4 mL 98% 的H2SO4，冷卻后將溶液定容至1 L，該比色液測(cè)定值為5～200 μg/mL，超過(guò)100 μg/mL時(shí)就應(yīng)稀釋。

1.1.3 培養(yǎng)基 TSA培養(yǎng)基用于洽草內(nèi)生細(xì)菌的分離；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于菌種的純化和保存；King氏培養(yǎng)基用于分泌IAA內(nèi)生細(xì)菌的篩選及定量測(cè)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 洽草內(nèi)生細(xì)菌的分離 先將植物樣品用清水洗凈，去除植物體表面的土壤及雜質(zhì)，后將多余水分風(fēng)干，稱取植物樣品2 g，采用高寒草地牧草內(nèi)生細(xì)菌分離的優(yōu)化方法進(jìn)行植物樣品表面的消毒和內(nèi)生細(xì)菌的分離＼[8＼]。植物樣品表面消毒后，在無(wú)菌條件下將植物樣品研碎，吸取200 μL植物組織液，涂布于TSA培養(yǎng)基上，置于28 ℃下培養(yǎng)數(shù)日，待菌落長(zhǎng)出后，純化分離的菌種并保存。

1.2.2 分泌IAA內(nèi)生細(xì)菌的初步篩選 將從洽草內(nèi)分離出的內(nèi)生細(xì)菌菌株采用Salkowski比色法進(jìn)行初步篩選＼[9＼]，然后，對(duì)篩選出的具有IAA分泌能力的菌種進(jìn)行定量測(cè)定。

1.2.3 分泌IAA內(nèi)生細(xì)菌的定量測(cè)定 采用分析純3IAA配制兩組標(biāo)準(zhǔn)溶液，第1組標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/L）依次為2.5，5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5；第2組標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（mg/L）依次為25，50，75，100，125，150，175 mg/L。吸取2 mL第1組標(biāo)準(zhǔn)液，加入等量的PC比色液；吸取2 mL第2組標(biāo)準(zhǔn)液，加入等量的S2比色液，都于室溫下黑暗處?kù)o置30 min，然后立即用分光光度計(jì)測(cè)定D530 nm值，每濃度梯度3個(gè)重復(fù)，記錄數(shù)據(jù)。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，每濃度梯度對(duì)應(yīng)的D530 nm值為縱坐標(biāo)，分別繪制PC比色液及S2比色液的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 菌株分泌IAA能力的定量測(cè)定 將篩選出的具有IAA分泌能力的菌株活化培養(yǎng)后接種到King氏培養(yǎng)基中，獲得其培養(yǎng)液，培養(yǎng)液離心（10 000 r/min）10 min，吸取適量上清液加入等量比色液，室溫下避光靜置30 min，立即用分光光度計(jì)測(cè)定相應(yīng)的D530 nm值，記錄數(shù)據(jù)，選用相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)菌株所分泌的IAA的量，根據(jù)PC比色液和S2比色液所測(cè)定的濃度范圍確定待測(cè)菌株分泌IAA的量。

1.2.5 分泌IAA內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物種子發(fā)芽的影響 供試草種選用苜蓿、紅三葉、黑麥草和燕麥，測(cè)定供試植物種子的千粒質(zhì)量。將篩選出的3株具有較好IAA分泌能力的內(nèi)生細(xì)菌活化后接種在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min搖床培養(yǎng)2 d，將培養(yǎng)液以1∶50的比例稀釋，用稀釋好的培養(yǎng)液浸泡供試植物種子12 h，將處理后的種子用紙上發(fā)芽法置于室溫下培養(yǎng)數(shù)日，每處理3個(gè)重復(fù)，每發(fā)芽床50粒種子，分別統(tǒng)計(jì)并測(cè)定不同種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率＼[10＼]及胚根長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 洽草內(nèi)生細(xì)菌的分離

實(shí)驗(yàn)從洽草共分離出內(nèi)生細(xì)菌31株，其中，根內(nèi)11株，莖和葉內(nèi)共分離出20株。

2.2 分泌IAA內(nèi)生細(xì)菌的初步篩選

用Salkowski比色法初步篩選后，共得到5株具有IAA分泌能力的內(nèi)生細(xì)菌。

2.3 分泌IAA內(nèi)生細(xì)菌的定量測(cè)定

2.3.1 比色標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）

2.3.2 菌株分泌IAA的定量測(cè)定 根據(jù)細(xì)菌在產(chǎn)生IAA過(guò)程中是否有色氨酸作為前體物質(zhì)，把細(xì)菌產(chǎn)生IAA的途徑分為色氨酸途徑和非色氨酸途徑。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明（表1），供試菌株中QS3、QG3、QS15和XB3都為非色氨酸途徑，只有菌株QA1為色氨酸途徑。且供試菌株分泌IAA的能力較弱，濃度都低于20 mg/L。

2.4 分泌IAA內(nèi)生細(xì)菌對(duì)植物種子發(fā)芽的影響

從種子千粒質(zhì)量測(cè)定結(jié)果可以看出，供試種子品質(zhì)較好，種粒較飽滿，種子的品質(zhì)不應(yīng)作為影響發(fā)芽實(shí)驗(yàn)的主要因素。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，供試植物種子用適當(dāng)濃度的菌液浸種后，與對(duì)照相比，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率均有不同程度的提高，發(fā)芽種子的胚根長(zhǎng)度有所增長(zhǎng)。且不同菌株間對(duì)供試植物種子的促生作用也有所差異，菌株QS3與QG3的促生作用與菌株QS15相比，差異顯著（P<0.05），但并未發(fā)現(xiàn)供試菌株培養(yǎng)液對(duì)植物種子發(fā)芽的影響有明顯的專一性，雖然豆科種子苜蓿、紅三葉，禾本科種子燕麥、黑麥草的生長(zhǎng)特性均有所優(yōu)化。

3 討論

3.1 洽草內(nèi)生細(xì)菌的分離

植物樣品表面消毒效果的優(yōu)劣直接影響了所分離內(nèi)生細(xì)菌種類及數(shù)量的多少，消毒時(shí)間過(guò)短，消毒不夠徹底，會(huì)導(dǎo)致植物體表面的微生物無(wú)法徹底除去；消毒時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)將植物體內(nèi)的部分內(nèi)生菌殺死，分離得到的內(nèi)生菌數(shù)量和種類減少，造成對(duì)內(nèi)生細(xì)菌多樣性的錯(cuò)誤統(tǒng)計(jì)，同時(shí)，在后期篩選過(guò)程中，供試菌種數(shù)量減少。正確選擇消毒劑并確定合適的消毒時(shí)間可以分離得到種類較為豐富的內(nèi)生細(xì)菌。目前，常用的消毒劑為酒精、NaClO、升汞、SDS等，且消毒劑濃度的選擇也有所不同＼[8，11＼]。潘羨心等＼[12＼]分離香蕉內(nèi)生細(xì)菌時(shí)，香蕉葉片和葉鞘采用了兩步消毒法，香蕉根則采用了三步消毒法，選用的消毒劑為乙醇和次氯酸鈉，并且所用乙醇和次氯酸鈉濃度分別為70%和3.25%，共獲得30株內(nèi)生細(xì)菌。

3.2 分泌IAA內(nèi)生細(xì)菌的篩選

實(shí)驗(yàn)中篩選到具有IAA分泌能力的內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)IAA能力均較弱，IAA分泌量都小于20 mg/L。篩選出的內(nèi)生細(xì)菌對(duì)供試牧草種子的發(fā)芽均有一定促生作用，說(shuō)明在菌株分泌低濃度IAA條件下，對(duì)植物種子的發(fā)芽有促生作用，但差異不顯著。實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)促生作用具有專一性，即對(duì)供試的豆科植物種子及禾本科植物種子的發(fā)芽均有一定促進(jìn)作用。劉琳等＼[13＼]從春蘭根組織中共分離出256株內(nèi)生細(xì)菌，其中，57株具有分泌IAA的能力，且產(chǎn)量高于50 μg/ mL的內(nèi)生細(xì)菌為9株（15.8%），產(chǎn)量介于20～50 μg/mL的內(nèi)生細(xì)菌為14株（24.6%），其余34株（59.7%）產(chǎn)量低于20 μg/mL。吳瑛等＼[14＼]研究燕麥根際固氮菌分泌IAA的動(dòng)態(tài)變化時(shí)，篩選出4株具有IAA分泌能力的菌株，且測(cè)定其分泌IAA能力分別為29.1、25.2、25.5、36.1 μg/mL。此次實(shí)驗(yàn)中篩選出的分泌IAA的內(nèi)生細(xì)菌與其相比，分泌量較少。

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