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        地黃飲子加減方對(duì)MCAO 模型大鼠血清HPA軸及其腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)研究

        2013-04-15 07:21:48唐璐孫塑倫高穎朱陵群
        環(huán)球中醫(yī)藥 2013年1期
        關(guān)鍵詞:飲子灌胃腦缺血

        唐璐 孫塑倫 高穎 朱陵群

        地黃飲子原方出自劉完素《宣明論方》:“治喑痱,腎虛弱厥逆,語(yǔ)聲不出,足軟不用”,作為滋腎陰、補(bǔ)腎陽(yáng)、化痰開(kāi)竅的代表方劑,它被廣泛運(yùn)用于腦血管病、癡呆、神經(jīng)系統(tǒng)變性病等的臨床治療。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察地黃飲子加減方對(duì)大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠血清HPA 軸激素水平及其腦細(xì)胞凋亡表達(dá)的干預(yù)效應(yīng),探討了缺血性中風(fēng)急性期應(yīng)用溫陽(yáng)補(bǔ)腎法對(duì)促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù),改善預(yù)后轉(zhuǎn)歸的作用機(jī)理。

        1 材料與方法

        1.1 動(dòng)物及分組

        成年SD 雄性大鼠30 只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司SPF/VAF 級(jí),合格證號(hào):SCXK(京)2006-0009)。體重(280±10)g。動(dòng)物稱(chēng)重編號(hào),用隨機(jī)數(shù)字表法[1]分為正常組、模型組、地黃飲子組,每組10 只。

        1.2 MCAO 模型制備

        模型組與地黃飲子組大鼠以大腦中動(dòng)脈線(xiàn)栓法造模。以10%水合氯醛(0.35 mg·kg-1)將大鼠麻醉后仰臥固定,常規(guī)備皮,沿頸部正中線(xiàn)切開(kāi)皮膚1.5 cm 左右,鈍性分離頸部肌群,以開(kāi)瞼器充分暴露手術(shù)野,分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)及 頸 外 動(dòng) 脈(external carotid artery,ECA),結(jié)扎ECA 及CCA 近心端,CCA 遠(yuǎn)心端穿線(xiàn)備用。動(dòng)脈夾夾閉ECA 分叉處。于CCA 剪開(kāi)一個(gè)小口,插入頭端直徑為0.28 mm 的栓線(xiàn)。輕輕結(jié)扎固定栓線(xiàn)于CCA 內(nèi),開(kāi)放動(dòng)脈夾,將栓線(xiàn)插入頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA),使其頭端到達(dá)大腦中動(dòng)脈起始處。扎緊固定線(xiàn),縫合皮膚。術(shù)中用100 W 燈泡照射,嚴(yán)格控制室溫??p合傷口,清理血跡,將術(shù)后大鼠置于電熱毯保持體溫,直至蘇醒。

        1.3 藥物制備及灌胃方法

        地黃飲子加減方配伍及劑量:熟附片4 g、巴戟天10 g、山萸肉10 g、熟地12 g、石斛10 g、肉蓯蓉12 g、五味子6 g、麥冬15 g。按人與動(dòng)物體型系數(shù)折算,等效比例為7,總生藥量316 g。將所有藥物用10 倍量和8 倍量的水煎煮2 次,每次1 小時(shí),合并水煎液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,制成含生藥1.0 g·ml-1的藥液備用,pH 值7.0。每日稱(chēng)重,按1 ml/100 g 的量連續(xù)灌胃7 天,其中地黃飲子組灌胃中藥藥液,模型組和正常組灌胃等量的生理鹽水,于最后一次灌胃后1 小時(shí)取材。至取材時(shí)模型組大鼠死亡2 只,原因?yàn)樾g(shù)后腹腔感染、灌胃失誤,剩余8 只;地黃飲子組大鼠死亡1 只,原因?yàn)楣辔甘д`,剩余9 只。

        1.4 主要試劑

        促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)放射免疫試劑盒;促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)放射免疫試劑盒;皮質(zhì)醇(cortisol,COR)放射免疫試劑盒:由解放軍總醫(yī)院科技開(kāi)發(fā)中心放免所提供。細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(TUNEL):美國(guó)羅氏公司進(jìn)口分裝。DAB 顯色試劑盒:北京中杉金橋生物有限公司。

        1.5 指標(biāo)檢測(cè)

        1.5.1 血清下丘腦—垂體—腎上腺軸(hypothalamopituitary-adrenal axis,HPA)軸 大鼠麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血4 ml,注入含30 μl EDTA、40 μl 抑肽酶的試管中靜置,4 ℃3000 轉(zhuǎn)/分離心15 分鐘,取上清存-80 ℃冰箱備用。通過(guò)上海核所日環(huán)光電儀器有限公司Sn-695B 型免疫計(jì)數(shù)器測(cè)定放射強(qiáng)度,記錄數(shù)值結(jié)果。

        1.5.2 細(xì)胞凋亡表達(dá)(TUNEL 免疫組化法)TUNEL 免疫組化法檢測(cè)細(xì)胞凋亡表達(dá),陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞核著棕黃色,陰性為細(xì)胞核著藍(lán)色。通過(guò)安裝在OlympusBX60 顯微鏡上的SPO-Ⅱ數(shù)碼成相軟件系統(tǒng)以及Metamorph 圖像分析軟件對(duì)TUNEL 免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行拍照分析。以統(tǒng)一的灰度值閾值作為度量標(biāo)準(zhǔn)界定陽(yáng)性染色部位,采用陽(yáng)性面積作為測(cè)量指標(biāo),每只大鼠選5 張切片,在20×10,40×10 的倍數(shù)下,于腦梗死中心區(qū),梗死周邊區(qū),對(duì)側(cè)正常區(qū)隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行拍照、測(cè)量,測(cè)定陽(yáng)性信號(hào)平均光密度值,讀取數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

        2 結(jié)果

        2.1 地黃飲子加減方對(duì)MCAO 模型大鼠血清HPA軸的干預(yù)作用

        正常組、地黃飲子組、模型組的ACTH、CRH、COR 各組數(shù)據(jù)經(jīng)K-S 檢驗(yàn)提示均符合正態(tài)分布,各組數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA 方差分析提示總體有差異,以L(fǎng)SD法進(jìn)行多組間比較,結(jié)果如表1 所示,在腦缺血發(fā)生后7 天,模型組的ACTH、CRH 含量均明顯低于正常組,COR 含量明顯高于正常組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;地黃飲子組的COR 明顯低于正常組、模型組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;地黃飲子組ACTH、CRH 含量均明顯高于模型組,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;ACTH、CRH 含量略低于正常組,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        表1 各組大鼠灌胃7 天后血漿HPA 軸含量變化

        2.2 地黃飲子對(duì)MCAO 大鼠缺血后腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)

        如圖1 ~3 所示,模型組、地黃飲子組梗死側(cè)大腦皮層區(qū)均可見(jiàn)凋亡陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá),胞核呈棕褐色,胞體縮小,染色不均,多集中于核膜下,可見(jiàn)核固縮和核碎裂。與模型組比較,經(jīng)地黃飲子加減方灌胃的大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)明顯減少。

        圖1 正常組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)(TUNEL 染色,×400)

        圖2 模型組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)

        圖3 地黃飲子組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)(TUNEL 染色,×400)

        正常組、地黃飲子組、模型組的腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)K-S 檢驗(yàn)提示均符合正態(tài)分布,各組數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA 方差分析提示總體有差異,以L(fǎng)SD法進(jìn)行多組間比較,結(jié)果如表2 所示,正常組為陰性,模型組、地黃飲子組腦組織與正常組相比均可見(jiàn)細(xì)胞凋亡表達(dá),差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.01);模型組腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)較地黃飲子組明顯,差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.01)。

        表2 地黃飲子對(duì)MCAO 模型大鼠缺血后腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)()

        表2 地黃飲子對(duì)MCAO 模型大鼠缺血后腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的干預(yù)效應(yīng)()

        注:與正常組比較aP <0.05;與正常組比較bP <0.01;與模型組比較cP <0.05;與模型組比較dP <0.01;

        分組 n 腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)95%CI正常組 10 0.00±0.00 (0.00,0.00)模型組 8 0.35±0.03ab (0.33,0.38)地黃飲子組 9 0.24±0.04abcd (0.22,0.27)

        2.3 MCAO 大鼠缺血后血清HPA 軸與腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的相關(guān)性分析

        地黃飲子組、模型組的腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)各組數(shù)據(jù)經(jīng)K-S 檢驗(yàn)提示均符合正態(tài)分布,以雙變量相關(guān)分析MCAO 大鼠血清HPA 軸含量與腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)的相關(guān)性,如表3 所示,模型組血清ACTH 含量與腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,但CRH、COR 則與凋亡表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性,地黃飲子組血清ACTH、CRH、COR 含量與腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)均無(wú)明顯相關(guān)性。

        3 討論

        根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果,地黃飲子能夠改善腦缺血大鼠HPA 軸的紊亂狀態(tài),通過(guò)提高CRH 含量抑制了大鼠體內(nèi)COR 的釋放。這一結(jié)果支持了鐘歷勇、沈自尹等[2]提出的補(bǔ)腎藥可通過(guò)上調(diào)下丘腦CRF mRNA 表達(dá)來(lái)保護(hù)HPA 軸免受外源性皮質(zhì)醇的抑制,補(bǔ)腎藥對(duì)腎陽(yáng)虛證的主要調(diào)節(jié)點(diǎn)定位于下丘腦的觀點(diǎn)。

        表3 模型組、地黃飲子組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)與HPA 軸含量的相關(guān)性分析

        模型組、中藥組的梗死側(cè)大腦皮層區(qū)域均可見(jiàn)有凋亡陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá),經(jīng)地黃飲子加減方灌胃的中藥組大鼠腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)明顯減少。說(shuō)明地黃飲子可明顯抑制腦組織細(xì)胞凋亡的表達(dá)。王利軍[3]曾通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí),地黃飲子可能通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)生長(zhǎng)因子BDNF 及凋亡相關(guān)基因Bcl-2 和BAX 的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、對(duì)抗腦缺血的作用。另有實(shí)驗(yàn)證實(shí),加減地黃飲子可顯著提高缺血腦組織內(nèi)相關(guān)酶的活性,通過(guò)抗自由基損傷來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)凋亡表達(dá)的抑制。腦組織缺血缺氧后的損傷機(jī)制較為復(fù)雜,抗損傷的途徑也并不唯一,需進(jìn)一步研究。

        模型組ACTH 含量與腦組織細(xì)胞凋亡表達(dá)存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系,CRH、COR 與凋亡表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)性,說(shuō)明模型組血清ACTH 含量低于中藥組,細(xì)胞凋亡表達(dá)較之更為明顯,而其余指標(biāo)之間無(wú)明顯相關(guān)性的原因可能與樣本量偏少有一定的關(guān)系。提示地黃飲子加減方抑制細(xì)胞凋亡,發(fā)揮腦保護(hù)作用的功效可能是通過(guò)改善HPA 軸的紊亂狀態(tài)這一機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

        現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為,腎陽(yáng)虛證與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)(NEIS)有關(guān),腎陽(yáng)虛證在下丘腦—垂體—靶腺(腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、性腺和胸腺)軸不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂,且主要發(fā)病環(huán)節(jié)在下丘腦(或更高級(jí))的調(diào)節(jié)功能紊亂[4]。HPA 軸在機(jī)體接受應(yīng)激刺激后被激活,參與調(diào)控機(jī)體對(duì)應(yīng)激的急性反應(yīng),介導(dǎo)一系列的代謝和心血管的代償機(jī)制以克服應(yīng)激原對(duì)機(jī)體的威脅或?qū)?nèi)環(huán)境的擾亂作用,具有一定的積極意義。但過(guò)于劇烈的應(yīng)激反應(yīng)同時(shí)會(huì)促進(jìn)和加劇炎癥的發(fā)生,對(duì)免疫機(jī)制也有顯著的抑制效應(yīng),通過(guò)NEIS 對(duì)機(jī)體產(chǎn)生應(yīng)激損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明在腦缺血發(fā)生后早期使用中藥地黃飲子加減方,能夠穩(wěn)定下丘腦—垂體—腎上腺系統(tǒng)的功能狀態(tài),使應(yīng)激刺激和炎癥反應(yīng)的發(fā)生不至于過(guò)度劇烈,通過(guò)補(bǔ)腎的方法達(dá)到護(hù)腦的目的,在腦缺血急性期發(fā)揮了扶正的作用,對(duì)改善整體狀態(tài),縮短急性期病程,改善預(yù)后,都具有重要的臨床參考價(jià)值。

        中風(fēng)病的病位在腦,腦與腎密切相關(guān)。腎虛既是其發(fā)病基礎(chǔ),又是病情發(fā)展過(guò)程中影響預(yù)后和病情輕重的關(guān)鍵因素。鑒于腎與腦的密切關(guān)系及腎虛在中風(fēng)病因病機(jī)中的重要作用,在治療時(shí)對(duì)急性期患者早期通過(guò)補(bǔ)腎的方法扶助正氣,對(duì)幫助患者腦功能的恢復(fù),減輕腦功能損害具有重要的意義。

        [1] 苗明三.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:中國(guó)中醫(yī)藥出版社,1997:142.

        [2] Tsigos C,Chrousos GP.Physiology of the hypothalamic-pituitaryadrenal axis in health and dysregulation in psychiatric and autoimmune disorders[J].Endocrinol Metab Clin North Am,1994,23(3):451-466.

        [3] 王利軍.地黃飲子對(duì)大鼠腦缺血后腦內(nèi)相關(guān)因子的影響[D].北京:北京中醫(yī)藥大學(xué),2003.

        [4] 蔡定芳,沈自尹,陳曉紅,等.烏頭堿對(duì)大鼠下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素含量的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志,1996,16(9):544.

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