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        地黃飲子加減方對MCAO 模型大鼠血清HPA軸及其腦組織細胞凋亡表達的干預效應研究

        2013-04-15 07:21:48唐璐孫塑倫高穎朱陵群
        環(huán)球中醫(yī)藥 2013年1期
        關(guān)鍵詞:飲子灌胃腦缺血

        唐璐 孫塑倫 高穎 朱陵群

        地黃飲子原方出自劉完素《宣明論方》:“治喑痱,腎虛弱厥逆,語聲不出,足軟不用”,作為滋腎陰、補腎陽、化痰開竅的代表方劑,它被廣泛運用于腦血管病、癡呆、神經(jīng)系統(tǒng)變性病等的臨床治療。本實驗通過觀察地黃飲子加減方對大腦中動脈線栓(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠血清HPA 軸激素水平及其腦細胞凋亡表達的干預效應,探討了缺血性中風急性期應用溫陽補腎法對促進神經(jīng)功能恢復,改善預后轉(zhuǎn)歸的作用機理。

        1 材料與方法

        1.1 動物及分組

        成年SD 雄性大鼠30 只(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司SPF/VAF 級,合格證號:SCXK(京)2006-0009)。體重(280±10)g。動物稱重編號,用隨機數(shù)字表法[1]分為正常組、模型組、地黃飲子組,每組10 只。

        1.2 MCAO 模型制備

        模型組與地黃飲子組大鼠以大腦中動脈線栓法造模。以10%水合氯醛(0.35 mg·kg-1)將大鼠麻醉后仰臥固定,常規(guī)備皮,沿頸部正中線切開皮膚1.5 cm 左右,鈍性分離頸部肌群,以開瞼器充分暴露手術(shù)野,分離左側(cè)頸總動脈(common carotid artery,CCA)及 頸 外 動 脈(external carotid artery,ECA),結(jié)扎ECA 及CCA 近心端,CCA 遠心端穿線備用。動脈夾夾閉ECA 分叉處。于CCA 剪開一個小口,插入頭端直徑為0.28 mm 的栓線。輕輕結(jié)扎固定栓線于CCA 內(nèi),開放動脈夾,將栓線插入頸內(nèi)動脈(internal carotid artery,ICA),使其頭端到達大腦中動脈起始處。扎緊固定線,縫合皮膚。術(shù)中用100 W 燈泡照射,嚴格控制室溫??p合傷口,清理血跡,將術(shù)后大鼠置于電熱毯保持體溫,直至蘇醒。

        1.3 藥物制備及灌胃方法

        地黃飲子加減方配伍及劑量:熟附片4 g、巴戟天10 g、山萸肉10 g、熟地12 g、石斛10 g、肉蓯蓉12 g、五味子6 g、麥冬15 g。按人與動物體型系數(shù)折算,等效比例為7,總生藥量316 g。將所有藥物用10 倍量和8 倍量的水煎煮2 次,每次1 小時,合并水煎液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮,制成含生藥1.0 g·ml-1的藥液備用,pH 值7.0。每日稱重,按1 ml/100 g 的量連續(xù)灌胃7 天,其中地黃飲子組灌胃中藥藥液,模型組和正常組灌胃等量的生理鹽水,于最后一次灌胃后1 小時取材。至取材時模型組大鼠死亡2 只,原因為術(shù)后腹腔感染、灌胃失誤,剩余8 只;地黃飲子組大鼠死亡1 只,原因為灌胃失誤,剩余9 只。

        1.4 主要試劑

        促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)放射免疫試劑盒;促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)放射免疫試劑盒;皮質(zhì)醇(cortisol,COR)放射免疫試劑盒:由解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放免所提供。細胞凋亡原位檢測試劑盒(TUNEL):美國羅氏公司進口分裝。DAB 顯色試劑盒:北京中杉金橋生物有限公司。

        1.5 指標檢測

        1.5.1 血清下丘腦—垂體—腎上腺軸(hypothalamopituitary-adrenal axis,HPA)軸 大鼠麻醉后經(jīng)腹主動脈取血4 ml,注入含30 μl EDTA、40 μl 抑肽酶的試管中靜置,4 ℃3000 轉(zhuǎn)/分離心15 分鐘,取上清存-80 ℃冰箱備用。通過上海核所日環(huán)光電儀器有限公司Sn-695B 型免疫計數(shù)器測定放射強度,記錄數(shù)值結(jié)果。

        1.5.2 細胞凋亡表達(TUNEL 免疫組化法)TUNEL 免疫組化法檢測細胞凋亡表達,陽性細胞為細胞核著棕黃色,陰性為細胞核著藍色。通過安裝在OlympusBX60 顯微鏡上的SPO-Ⅱ數(shù)碼成相軟件系統(tǒng)以及Metamorph 圖像分析軟件對TUNEL 免疫組化染色結(jié)果進行拍照分析。以統(tǒng)一的灰度值閾值作為度量標準界定陽性染色部位,采用陽性面積作為測量指標,每只大鼠選5 張切片,在20×10,40×10 的倍數(shù)下,于腦梗死中心區(qū),梗死周邊區(qū),對側(cè)正常區(qū)隨機選取5 個視野進行拍照、測量,測定陽性信號平均光密度值,讀取數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

        1.6 統(tǒng)計學處理

        2 結(jié)果

        2.1 地黃飲子加減方對MCAO 模型大鼠血清HPA軸的干預作用

        正常組、地黃飲子組、模型組的ACTH、CRH、COR 各組數(shù)據(jù)經(jīng)K-S 檢驗提示均符合正態(tài)分布,各組數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA 方差分析提示總體有差異,以LSD法進行多組間比較,結(jié)果如表1 所示,在腦缺血發(fā)生后7 天,模型組的ACTH、CRH 含量均明顯低于正常組,COR 含量明顯高于正常組,差異有顯著統(tǒng)計學意義;地黃飲子組的COR 明顯低于正常組、模型組,差異有顯著統(tǒng)計學意義;地黃飲子組ACTH、CRH 含量均明顯高于模型組,差異有顯著統(tǒng)計學意義;ACTH、CRH 含量略低于正常組,差異無統(tǒng)計學意義。

        表1 各組大鼠灌胃7 天后血漿HPA 軸含量變化

        2.2 地黃飲子對MCAO 大鼠缺血后腦組織細胞凋亡表達的干預效應

        如圖1 ~3 所示,模型組、地黃飲子組梗死側(cè)大腦皮層區(qū)均可見凋亡陽性細胞表達,胞核呈棕褐色,胞體縮小,染色不均,多集中于核膜下,可見核固縮和核碎裂。與模型組比較,經(jīng)地黃飲子加減方灌胃的大鼠腦組織細胞凋亡表達明顯減少。

        圖1 正常組大鼠腦組織細胞凋亡表達(TUNEL 染色,×400)

        圖2 模型組大鼠腦組織細胞凋亡表達

        圖3 地黃飲子組大鼠腦組織細胞凋亡表達(TUNEL 染色,×400)

        正常組、地黃飲子組、模型組的腦組織細胞凋亡表達數(shù)據(jù)經(jīng)K-S 檢驗提示均符合正態(tài)分布,各組數(shù)據(jù)經(jīng)ANOVA 方差分析提示總體有差異,以LSD法進行多組間比較,結(jié)果如表2 所示,正常組為陰性,模型組、地黃飲子組腦組織與正常組相比均可見細胞凋亡表達,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P <0.01);模型組腦組織細胞凋亡表達較地黃飲子組明顯,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P <0.01)。

        表2 地黃飲子對MCAO 模型大鼠缺血后腦組織細胞凋亡表達的干預效應()

        表2 地黃飲子對MCAO 模型大鼠缺血后腦組織細胞凋亡表達的干預效應()

        注:與正常組比較aP <0.05;與正常組比較bP <0.01;與模型組比較cP <0.05;與模型組比較dP <0.01;

        分組 n 腦組織細胞凋亡表達95%CI正常組 10 0.00±0.00 (0.00,0.00)模型組 8 0.35±0.03ab (0.33,0.38)地黃飲子組 9 0.24±0.04abcd (0.22,0.27)

        2.3 MCAO 大鼠缺血后血清HPA 軸與腦組織細胞凋亡表達的相關(guān)性分析

        地黃飲子組、模型組的腦組織細胞凋亡表達各組數(shù)據(jù)經(jīng)K-S 檢驗提示均符合正態(tài)分布,以雙變量相關(guān)分析MCAO 大鼠血清HPA 軸含量與腦組織細胞凋亡表達的相關(guān)性,如表3 所示,模型組血清ACTH 含量與腦組織細胞凋亡表達存在顯著負相關(guān)關(guān)系,但CRH、COR 則與凋亡表達無明顯相關(guān)性,地黃飲子組血清ACTH、CRH、COR 含量與腦組織細胞凋亡表達均無明顯相關(guān)性。

        3 討論

        根據(jù)本實驗結(jié)果,地黃飲子能夠改善腦缺血大鼠HPA 軸的紊亂狀態(tài),通過提高CRH 含量抑制了大鼠體內(nèi)COR 的釋放。這一結(jié)果支持了鐘歷勇、沈自尹等[2]提出的補腎藥可通過上調(diào)下丘腦CRF mRNA 表達來保護HPA 軸免受外源性皮質(zhì)醇的抑制,補腎藥對腎陽虛證的主要調(diào)節(jié)點定位于下丘腦的觀點。

        表3 模型組、地黃飲子組大鼠腦組織細胞凋亡表達與HPA 軸含量的相關(guān)性分析

        模型組、中藥組的梗死側(cè)大腦皮層區(qū)域均可見有凋亡陽性細胞的表達,經(jīng)地黃飲子加減方灌胃的中藥組大鼠腦組織細胞凋亡表達明顯減少。說明地黃飲子可明顯抑制腦組織細胞凋亡的表達。王利軍[3]曾通過實驗證實,地黃飲子可能通過調(diào)節(jié)神經(jīng)生長因子BDNF 及凋亡相關(guān)基因Bcl-2 和BAX 的表達來發(fā)揮抑制細胞凋亡、對抗腦缺血的作用。另有實驗證實,加減地黃飲子可顯著提高缺血腦組織內(nèi)相關(guān)酶的活性,通過抗自由基損傷來實現(xiàn)對凋亡表達的抑制。腦組織缺血缺氧后的損傷機制較為復雜,抗損傷的途徑也并不唯一,需進一步研究。

        模型組ACTH 含量與腦組織細胞凋亡表達存在顯著的負相關(guān)關(guān)系,CRH、COR 與凋亡表達無明顯相關(guān)性,說明模型組血清ACTH 含量低于中藥組,細胞凋亡表達較之更為明顯,而其余指標之間無明顯相關(guān)性的原因可能與樣本量偏少有一定的關(guān)系。提示地黃飲子加減方抑制細胞凋亡,發(fā)揮腦保護作用的功效可能是通過改善HPA 軸的紊亂狀態(tài)這一機制來實現(xiàn)的。

        現(xiàn)代醫(yī)學研究認為,腎陽虛證與神經(jīng)內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)(NEIS)有關(guān),腎陽虛證在下丘腦—垂體—靶腺(腎上腺皮質(zhì)、甲狀腺、性腺和胸腺)軸不同環(huán)節(jié)、不同程度的功能紊亂,且主要發(fā)病環(huán)節(jié)在下丘腦(或更高級)的調(diào)節(jié)功能紊亂[4]。HPA 軸在機體接受應激刺激后被激活,參與調(diào)控機體對應激的急性反應,介導一系列的代謝和心血管的代償機制以克服應激原對機體的威脅或?qū)?nèi)環(huán)境的擾亂作用,具有一定的積極意義。但過于劇烈的應激反應同時會促進和加劇炎癥的發(fā)生,對免疫機制也有顯著的抑制效應,通過NEIS 對機體產(chǎn)生應激損傷。本實驗結(jié)果說明在腦缺血發(fā)生后早期使用中藥地黃飲子加減方,能夠穩(wěn)定下丘腦—垂體—腎上腺系統(tǒng)的功能狀態(tài),使應激刺激和炎癥反應的發(fā)生不至于過度劇烈,通過補腎的方法達到護腦的目的,在腦缺血急性期發(fā)揮了扶正的作用,對改善整體狀態(tài),縮短急性期病程,改善預后,都具有重要的臨床參考價值。

        中風病的病位在腦,腦與腎密切相關(guān)。腎虛既是其發(fā)病基礎,又是病情發(fā)展過程中影響預后和病情輕重的關(guān)鍵因素。鑒于腎與腦的密切關(guān)系及腎虛在中風病因病機中的重要作用,在治療時對急性期患者早期通過補腎的方法扶助正氣,對幫助患者腦功能的恢復,減輕腦功能損害具有重要的意義。

        [1] 苗明三.實驗動物和動物實驗技術(shù)[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,1997:142.

        [2] Tsigos C,Chrousos GP.Physiology of the hypothalamic-pituitaryadrenal axis in health and dysregulation in psychiatric and autoimmune disorders[J].Endocrinol Metab Clin North Am,1994,23(3):451-466.

        [3] 王利軍.地黃飲子對大鼠腦缺血后腦內(nèi)相關(guān)因子的影響[D].北京:北京中醫(yī)藥大學,2003.

        [4] 蔡定芳,沈自尹,陳曉紅,等.烏頭堿對大鼠下丘腦促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素含量的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合雜志,1996,16(9):544.

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