李 賓，宋振全，梁國(guó)標(biāo)，趙 旭，毛振立，李曉明，呂 偉，雷 偉，蔣 為

我們前期的研究證實(shí)8-OH-DPAT在大鼠創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)后能夠通過(guò)降低腦溫抑制神經(jīng)元的凋亡［1］。國(guó)外研究報(bào)告顯示5-HT1A受體激動(dòng)劑在多種腦損傷模型中具有神經(jīng)保護(hù)作用，能夠促進(jìn)運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知功能的恢復(fù)及減輕腦組織病理學(xué)表現(xiàn)［2－4］。然而，8-OH-DPAT對(duì)TBI后神經(jīng)元凋亡的影響研究還不充分［5－6］，并且8-OHDPAT對(duì)二次腦損傷的影響未知。我們制作二次腦損傷模型，研究8-OH-DPAT對(duì)大鼠彌漫性腦損傷及合并二次腦損傷后的神經(jīng)元凋亡的影響。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)分組

182只(330±25)g健康雄性Wister大鼠隨機(jī)分為6組:空白對(duì)照組(A組，n=7)，假手術(shù)組(B組)，單純DBI+NS對(duì)照組(C組)，單純DBI+8-OH-DPAT治療組(D組)，DBI合并SBI+NS對(duì)照組(E組)，DBI合并SBI+8-OH-DPAT治療組(F組);B、C、D、E、F各組根據(jù)傷后取腦時(shí)間分為6、12、24、72、168h亞組，各亞組7只，n=35。A組不做任何損傷，B組除了不接受鐵棒打擊和雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎其余手術(shù)操作同E組，DBI模型參照Marmarou方法制作，DBI后穩(wěn)定15min，結(jié)扎大鼠雙側(cè)頸總動(dòng)脈30min，做成缺血性二次腦損傷模型。

2 藥物應(yīng)用及取材

A、B組不使用任何藥物;D、F組在DBI 15min后腹腔注射8-OH-DPAT(0.5mg/kg)［2－4］，8-OHDPAT(5mg/支)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;C、E組在DBI 15min后腹腔注射等體積的NS;E、F組注射藥物或NS后再施加二次損傷。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后，常規(guī)方法取腦、石蠟包埋，備做切片。

3 觀察指標(biāo)

將每只大鼠隨機(jī)抽取5張切片分別觀察以下指標(biāo)，每張切片任取5個(gè)視野在400倍光鏡下觀察，取其平均值。

3.1 蘇木精-伊紅(HE)染色觀察前額皮層病理表現(xiàn)。

3.2 TUNEL法檢測(cè)前額皮層細(xì)胞凋亡:凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)買自北京中衫金橋公司，求出每張切片各視野的凋亡指數(shù)(凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%)。

3.3 免疫組化檢測(cè)前額皮層神經(jīng)元Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白的表達(dá):抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件(Media Cybernetics公司)觀察各組切片Caspase-3、Bcl-2、Bax陽(yáng)性表達(dá)的積分光密度(integral optical density，IOD)值并進(jìn)行比較。

4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。

結(jié) 果

1 HE染色可見(jiàn)A、B組無(wú)損傷表現(xiàn);C、D、E、F組有明顯的腦組織水腫、神經(jīng)元變性、細(xì)胞數(shù)目減少、毛細(xì)血管充血、炎細(xì)胞浸潤(rùn)，與A、B組比較E組損傷最為明顯，D組表現(xiàn)最輕;D組用藥后損傷較C組減輕，F(xiàn)組較E組也有減輕(見(jiàn)圖1)。

圖1 各組72h亞組前額皮層病理表現(xiàn)(HE×400)

2 A、B組凋亡細(xì)胞少見(jiàn)，陽(yáng)性反應(yīng)為細(xì)胞核染色呈明確棕黃色，A組凋亡指數(shù)為(1.36±0.14)%，各損傷組于損傷后6h即可見(jiàn)凋亡細(xì)胞，逐漸增多，72h時(shí)達(dá)高峰，第7d仍有較高的表現(xiàn);D組用藥后較C組降低(P＜0.05或P＜0.01)，同樣可見(jiàn)F組小于E組(P＜0.01)(見(jiàn)表1，圖2)。

3 Caspase-3陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿內(nèi)棕黃色顆粒，A、B組Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)少見(jiàn);與A、B組比較，各損傷組各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，尤其在損傷后72h增多最明顯(P＜0.01);D組用藥后較C組表達(dá)減少(P＜0.05或P＜0.01)，同樣可見(jiàn)F組表達(dá)低于E組(P＜0.05或P＜0.01)(見(jiàn)表2，圖3)。

4 Bax陽(yáng)性表現(xiàn)為胞漿內(nèi)黃染顆粒，A、B組Bax陽(yáng)性表達(dá)少見(jiàn);與A、B組比較，各損傷組各時(shí)間點(diǎn)腦損傷后Bax表達(dá)明顯增多(P＜0.01)，72h可見(jiàn)高峰，7d后有所降低;D組用藥后表達(dá)較C組降低(P＜0.05或P＜0.01)，同樣可見(jiàn)F組表達(dá)低于E組(P＜0.05或P＜0.01)(見(jiàn)表3，圖4)。

5 Bcl-2陽(yáng)性表現(xiàn)同Bax，A、B組即可見(jiàn)Bcl-2的少量表達(dá);各損傷組6h Bcl-2表達(dá)可見(jiàn)增多，24h達(dá)高峰，之后逐漸減少;與A、B組比較，各損傷組各時(shí)間點(diǎn)Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)明顯增多(P＜0.01);D組用藥后較C組促進(jìn)了Bcl-2的表達(dá)(P＜0.05或P＜0.01)，同樣F組表達(dá)高于E組(P＜0.05或P＜0.01)(見(jiàn)表4，圖5)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)凋亡指數(shù)(%)觀察結(jié)果

表2 各組不同時(shí)點(diǎn)Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)情況比較(IOD)

表3 各組不同時(shí)點(diǎn)Bax的表達(dá)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(IOD)

表4 各組不同時(shí)點(diǎn)Bcl-2的表達(dá)結(jié)果統(tǒng)計(jì)(IOD)

圖2 各損傷組72h亞組細(xì)胞凋亡表現(xiàn)(TUNEL染色 ×400)。鏡下見(jiàn)凋亡細(xì)胞胞體縮小，核膜皺縮，染色質(zhì)濃縮，濃集于核膜附近，核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，核不規(guī)則、固縮塊狀濃染呈棕黃色

圖3 各損傷組72h亞組腦組織Caspase-3的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×400)。鏡下見(jiàn)胞漿有黃染，尤其是核膜周圍黃染最為明顯，D、F組用藥后Caspase-3的表達(dá)減少

圖4 各損傷組72h亞組前額皮層Bax的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×400)。可見(jiàn)各損傷組胞漿有黃染，E組表達(dá)最為明顯，D組表現(xiàn)最輕(只在核膜周圍可見(jiàn))

圖5 各損傷組24h亞組前額皮層Bcl-2的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色 ×400)。上圖神經(jīng)元及胞核清晰可見(jiàn)，各組在胞漿內(nèi)均有Bcl-2蛋白的表達(dá)，尤其在核膜周圍有大量的聚集

討 論

DBI是臨床常見(jiàn)的TBI類型，主要以非手術(shù)綜合治療，尚缺少針對(duì)神經(jīng)元凋亡的有效藥物治療。TBI后除了最初的損傷還有二次的腦損傷［3］，最初的損傷是不可逆的，比如損傷區(qū)域的細(xì)胞壞死，然而低氧、低血壓等二次損傷因素會(huì)持續(xù)幾分鐘到幾小時(shí)甚至更久，這為藥物發(fā)揮作用提供了時(shí)機(jī)。在臨床工作中二次腦損傷很常見(jiàn)，即便是在重癥監(jiān)護(hù)室二次損傷因素依然難以避免［4］。通過(guò)后期治療盡可能減弱或阻止二次損傷的發(fā)生，可提高患者的功能預(yù)后。2001年Kline等［7］第一次報(bào)道了5-HT1A受體激動(dòng)劑在TBI中的神經(jīng)保護(hù)作用，后續(xù)的一些實(shí)驗(yàn)主要集中于觀察大鼠運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能的恢復(fù)［2－4］。研究認(rèn)為8-OH-DPAT提供的這種神經(jīng)保護(hù)作用與抑制谷氨酸鹽釋放、抑制細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流、引起神經(jīng)元超極化、保護(hù)腦組織多巴胺及膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)等有關(guān)［2－4，7］。

DBI及SBI模型制作方便，實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單，便于操作，穩(wěn)定重復(fù)性好。HE染色觀察可見(jiàn)腦組織水腫，細(xì)胞水腫、變性壞死，血管充血，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，C、E鹽水對(duì)照組損傷比相應(yīng)的D、F藥物組損傷重，說(shuō)明8-OH-DPAT具有神經(jīng)保護(hù)作用，和一些研究的結(jié)果是相吻合的［1－4］。

Caspase-3在細(xì)胞凋亡中具有重要作用，在Caspases家族中處于核心位置，是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者［8］?；罨腃aspase-3能特異性地切割DNA，使參與DNA損傷修復(fù)過(guò)程的聚ADP核糖聚合酶(PARP)以及DNA依賴的蛋白激酶(DNA-PK)等失活，促使染色質(zhì)凝聚和核酶激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［1］。若細(xì)胞中檢出活化的Caspase-3和(或)細(xì)胞TUNEL染色(+)則有細(xì)胞凋亡存在［9］。Adayev等［5］研究5-HT1A G蛋白偶聯(lián)抑制Caspase-3其可能機(jī)制見(jiàn)圖6。實(shí)驗(yàn)顯示給予8-OH-DPAT后，細(xì)胞凋亡減少，Caspase-3表達(dá)降低，表明8-OHDPAT可通過(guò)減少Caspase-3表達(dá)，抑制DBI后的細(xì)胞凋亡同時(shí)能夠減弱二次損傷。

Bcl-2的過(guò)量表達(dá)可以抑制凋亡發(fā)生，主要通過(guò)穩(wěn)定線粒體膜阻止線粒體釋放Caspase、凋亡誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素C等作用抑制細(xì)胞凋亡［10］。Bax可與Bcl-2形成異源二聚體使凋亡易于發(fā)生［11］，同時(shí)Bax可以促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，從而激活Caspase-3誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生，因此Bax高表達(dá)可能是顱腦損傷后細(xì)胞凋亡增加的主要原因。兩者對(duì)細(xì)胞凋亡調(diào)控作用相反，認(rèn)為它們之間可能存在一種平衡共同調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡［1］。Hsiung等［6］研究8-OH-DPAT抑制AC從而阻斷Caspase-3的活化途徑，其可能機(jī)制見(jiàn)圖7。實(shí)驗(yàn)觀察了8-OH-DPAT對(duì)大鼠腦損傷后前額皮質(zhì)Bcl-2及Bax表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可在一定程度上提高Bcl-2的表達(dá)，同時(shí)抑制Bax的表達(dá)，說(shuō)明8-OH-DPAT可通過(guò)調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2的表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

圖6 5-HT1A受體激動(dòng)劑抑制Caspase-3的可能機(jī)制

圖7 8-OH-DPAT抑制Bax/Bcl-2的可能機(jī)制

實(shí)驗(yàn)證實(shí)了8-OH-DPAT可抑制DBI后的細(xì)胞凋亡，同時(shí)對(duì)SBI有一定的抑制作用，研究8-OHDPAT對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，有助于為臨床治療DBI及防治SBI提供參考依據(jù)。8-OH-DPAT通過(guò)抑制Caspase-3蛋白表達(dá)、降低Bax表達(dá)、促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)發(fā)揮其抗凋亡作用。本實(shí)驗(yàn)的用藥方式、時(shí)間及劑量參照以往的研究，存在一定的局限性，例如用藥是在腦損傷15min后，這在臨床很難實(shí)現(xiàn)，需要更進(jìn)一步的研究。8-OH-DPAT抑制凋亡的機(jī)制是多方面的，還需進(jìn)一步探索。

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