柳勤譯，陳曉武，楊小喬，許鳴

(廣東省第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 510317)

乙型肝炎是一種全球性分布的病毒傳染病，其感染面廣，傳染性強(qiáng)，易慢性化。我國(guó)每年約有40萬(wàn)人死于與慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，HBV)相關(guān)的疾病，抗病毒治療是治療HBV最主要的治療措施，目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)批準(zhǔn)有效的抗HBV藥物主要包括干擾素類[1]和核苷(酸)類似物(nucleoside analogues，NA)，但單一抗病毒藥如干擾素需注射治療，不良反應(yīng)較大，不適用于肝硬化失代償期和白細(xì)胞及血小板明顯減少的肝病患者；核苷類藥物，其中以拉米夫定療效最為確切。細(xì)胞研究證實(shí)，拉米夫定能有效抑制HBV復(fù)制，但僅僅抑制病毒DNA的復(fù)制量及其復(fù)制中間體的產(chǎn)量，核苷類藥物療程難以確定，因此在停止用藥后可發(fā)生反跳，長(zhǎng)期應(yīng)用可產(chǎn)生耐藥突變，且副作用大，費(fèi)用高。與干擾素和核苷類藥物相比，傳統(tǒng)中藥在長(zhǎng)期治療HBV過(guò)程中體現(xiàn)了其療效穩(wěn)定、毒副作用小的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。中草藥治療HBV的有效性在于它具有促進(jìn)肝臟細(xì)胞的修復(fù)、保護(hù)細(xì)胞膜、調(diào)節(jié)免疫功能和抑制病毒復(fù)制等方面的作用。茅莓是一種傳統(tǒng)民間中藥，據(jù)《中藥大辭典》記載，茅莓的根、莖和葉均可藥用，用于治療肝脾腫大、黃疸、慢性肝炎等[2]。目前有國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道茅莓提取物(乙酸乙酯部分)對(duì)HBsAg和HBeAg兩種抗原的表達(dá)均有抑制作用，但尚無(wú)茅莓提取物(乙酸乙酯部分)在體內(nèi)抗乙型肝炎病毒相關(guān)方面的報(bào)道，為此進(jìn)行本研究。

1 材料與方法

1.1 藥物 受試藥物茅莓提取物(乙酸乙酯部分)，為粉末劑由南方醫(yī)科大學(xué)藥理教研室提供。陽(yáng)性藥選擇：選擇對(duì)鴨乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus，DHBV)抑制作用較強(qiáng)的拉米夫定作為陽(yáng)性對(duì)照藥，規(guī)格0.1 g，中國(guó)蘇州葛蘭素史克制藥(蘇州)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H20070581。

1.2 動(dòng)物 3日齡麻鴨，購(gòu)自廣西臨桂縣五通鎮(zhèn)孵化場(chǎng)，體重約50 g/只，常規(guī)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，相對(duì)濕度60%～80%，定時(shí)通風(fēng)換氣，每日約12 h光照。飼料：寶鼎501小鴨飼料，由穗屏企業(yè)有限公司飼料廠生產(chǎn)，40 kg/包。

1.3 主要試劑及儀器 Taq酶，10×PCR buffer、dNTP mixture、6×loading buffer，均購(gòu)自北京賽百盛生物工程有限公司。引物由北京賽百盛生物工程有限公司合成，梯度聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)儀，mastercycler gradint 型號(hào)5331。高速離心機(jī)，Eppenolf 型號(hào)5415D。Dyy-6C型電泳儀。NC膜：購(gòu)自Amersham公司；DHBV質(zhì)粒：由廣州中醫(yī)藥大學(xué)熱帶病研究所病毒室提供；缺口翻譯藥盒：購(gòu)自promega公司；α-32 p-dCTP，購(gòu)自北京亞輝公司；Sephadex G-50：購(gòu)自Pharmacia公司；96孔雜交點(diǎn)樣器：美國(guó)Bio-rad公司產(chǎn)品；蓋革氏計(jì)數(shù)器：美國(guó)S.E.International 公司產(chǎn)品。常規(guī)HE染色所需試劑由南方醫(yī)科大學(xué)組胚教研室提供。

1.4 方法

1.4.1 模型篩選 DHBV陽(yáng)性鴨子的篩選：3日齡麻鴨200只于第2天經(jīng)脛靜脈取血，分離血清后，用常規(guī)PCR方法檢測(cè)DHBV，第5天出結(jié)果，篩選出先天感染DHBV鴨65只。

1.4.2 分組與給藥 取經(jīng)PCR方法篩選出的先天感染DHBV鴨50只，隨機(jī)分為5組，每組10只：茅莓提取物400、200、100 mg/kg組，生理鹽水對(duì)照組1 ml/kg；拉米夫定50 mg/kg組，每天灌胃2次，連續(xù)灌胃21 d。

1.4.3 取樣方法 在給藥前(T0)，用藥后7 d(T7)、14 d(T14)、21 d(T21)，停藥后3 d(P3)、7 d(P7)自脛靜脈取血分離血清，-20 ℃凍存待檢。停藥7 d后將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物全部頸動(dòng)脈放血處死，立即摘取肝臟，取肝右葉相同部位組織0.5 cm×0.5 cm大小，用10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋切片，HE染色待檢。

1.4.4 DHBV-DNA 檢測(cè)方法取上述鴨血清采用斑點(diǎn)雜交法，每批同時(shí)點(diǎn)膜，測(cè)定鴨血清中DHBV-DNA水平的變化，按缺口翻譯試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，用32P標(biāo)記DHBV-DNA探針，并作鴨血清DNA斑點(diǎn)雜交，放射自顯影膜片斑點(diǎn)，在酶標(biāo)檢測(cè)儀上測(cè)定OD值(濾光片波長(zhǎng)為490 nm)，計(jì)算鴨血清DHBV-DNA密度。

1.4.5 肝組織病理學(xué)觀察 參照2001年《病毒性肝炎防治方案》及目前國(guó)際上常用Knodell HAI、Ishak、Scheuer 和Chevallier 等評(píng)分系統(tǒng)或半定量計(jì)分方案，了解肝臟炎癥病理變化程度，以及評(píng)價(jià)藥物療效。本實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)：細(xì)胞水腫、氣球樣變、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、點(diǎn)狀壞死。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察HBV肝組織：(1)細(xì)胞水腫：不出現(xiàn)者為(-)；占肝小葉1/2～1/3者為(+)；占肝小葉1/2以上者為(++)；肝小葉廣泛水腫者為(+++)。(2)氣球樣變：評(píng)分同細(xì)胞水腫。(3)間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)：未見(jiàn)者為(-)；偶見(jiàn)者為(+)；廣泛可見(jiàn)者為(+++)；居于(+)與(+++)之間者為(++)。(4)壞死：不出現(xiàn)為(-)；肝小葉出現(xiàn)1～2個(gè)壞死灶者為(+)；出現(xiàn)3～4個(gè)壞死者(++)，出現(xiàn)4個(gè)以上壞死灶者為(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組計(jì)量資料分析采用One-way ANOVA，多重比較采用最小顯著差數(shù)法(least significant difference，LSD)；雙向有序等級(jí)資料采用線趨勢(shì)檢驗(yàn)，兩兩比較采用S-N-K法。

2 結(jié)果

2.1 鴨血清DHBV-DNA檢測(cè)結(jié)果 鹽水對(duì)照組動(dòng)物血清DHBV-DNA水平穩(wěn)定。拉米夫定口服21 d可顯著抑制血清DHBV-DNA，停藥3 d和7 d后DHBV-DNA顯著回升。茅莓提取物各劑量組各時(shí)點(diǎn)血清DHBV-DNA變化差異無(wú)顯著性，見(jiàn)表1。

表1 茅莓提取物在鴨體內(nèi)對(duì)DHBV-DNA的抑制作用

注：與對(duì)照組相同時(shí)間比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與同組T0比較：3)P<0.01

2.2 肝組織病理學(xué)顯微鏡觀察 茅莓提取物大劑量組的鴨肝組織內(nèi)可見(jiàn)重度細(xì)胞水腫，但氣球樣變較其他各組輕，未見(jiàn)壞死、纖維化和間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組及各藥物組動(dòng)物均可見(jiàn)肝細(xì)胞重度細(xì)胞水腫、氣球樣變性，幾乎無(wú)點(diǎn)灶狀及碎屑樣壞死，無(wú)纖維增生，可見(jiàn)輕度間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，這些病理表現(xiàn)各組差異無(wú)顯著性(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組鴨肝病理變化結(jié)果

注：各組肝組織病理檢查，P>0.05

3 討論

HBV屬于嗜肝DNA病毒科，這個(gè)家族的所有病毒都很小，嗜肝性，毒粒形態(tài)和基因組相似，復(fù)制經(jīng)RNA逆轉(zhuǎn)錄，毒粒形態(tài)和基因組相似，復(fù)制經(jīng)RNA逆轉(zhuǎn)錄。一些哺乳動(dòng)物和禽類嗜肝病毒的發(fā)現(xiàn)為人類研究人乙型肝炎病毒的生物學(xué)相關(guān)機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)和道德倫理上的便利。由于禽類嗜肝病毒的DHBV與人乙型肝炎病毒均屬于嗜肝病毒科，兩者在毒粒形態(tài)、結(jié)構(gòu)、基因組成、復(fù)制及傳播方式等方面均很相似[3-5]。國(guó)內(nèi)目前多選用后天感染的鴨為肝炎的動(dòng)物模型。國(guó)外學(xué)者目前普遍采用DHBV感染1～3日齡雛鴨建立乙型肝炎動(dòng)物模型，通過(guò)比較，先天感染DHBV的雛鴨較后天感染模型的血清病毒持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，病毒滴度高；對(duì)肝組織的炎性反應(yīng)長(zhǎng)期存在，細(xì)胞病變較為明顯，其病毒血癥持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)且較穩(wěn)定，無(wú)明顯的自然轉(zhuǎn)陰現(xiàn)象，是研究人類乙型肝炎發(fā)病機(jī)制、病毒復(fù)制過(guò)程及篩選有效治療藥物的理想動(dòng)物模型[6]。本研究發(fā)現(xiàn)：鹽水對(duì)照組鴨血清DHBV-DNA水平穩(wěn)定，陽(yáng)性藥物拉米夫定可顯著抑制血清DHBV-DNA，停藥3 d和7 d DHBV-DNA顯著回升，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道的結(jié)果和臨床結(jié)果都相吻合。國(guó)內(nèi)外學(xué)者報(bào)道茅莓提取物(乙酸乙酯部分)對(duì)HBsAg和HBeAg兩種抗原的表達(dá)均有抑制作用，且在96 h達(dá)高峰，并呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性，這說(shuō)明茅莓提物(乙酸乙酯部分)在體外有抗乙型肝炎病毒的作用，然而在體內(nèi)茅莓提取物(乙酸乙酯部分)各劑量組21 d療程各時(shí)點(diǎn)血清DHBV-DNA變化差異無(wú)顯著性[7-8]。這結(jié)果顯示茅莓提取物經(jīng)過(guò)體內(nèi)代謝后在鴨體內(nèi)對(duì)DHBV-DNA無(wú)抑制作用。考慮原因有：(1)茅莓提取物在體內(nèi)確實(shí)無(wú)抗病毒作用，與國(guó)內(nèi)報(bào)道的有相當(dāng)多的藥物體外有抑制病毒復(fù)制作用，而體內(nèi)并無(wú)抗病毒作用相一致。(2)給藥劑量不足不能達(dá)有效血藥濃度，茅莓提取物在細(xì)胞試驗(yàn)中已表現(xiàn)出對(duì)HBsAg和HBeAg的表達(dá)抑制，并呈現(xiàn)出濃度依賴性和時(shí)間依賴性。(3)給藥途徑的影響，茅莓提取物在給鴨灌胃經(jīng)鴨體內(nèi)代謝后抗病毒的有效成分可能已經(jīng)被破壞。(4)給藥時(shí)間可能太短，目前常用兩大類抗病毒藥物都需要長(zhǎng)期用藥，作用機(jī)制不同，藥物起效需要的時(shí)間也不一樣。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)：茅莓提取物(乙酸乙酯部分)抗乙型肝炎病毒作用主要是通過(guò)其原形發(fā)揮作用，該原形在麻鴨體內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝后，失去抗乙型肝炎病毒的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]拉米夫定臨床應(yīng)用專家組．2003年拉米夫定臨床應(yīng)用專家共識(shí)[J]．中華肝臟病雜志，2003，11(8)：497．

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué)．中藥大辭典[M]．2版．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：2699.

[3]斯崇文，王勤環(huán)．傳染病學(xué)[M]．北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2004：2.

[4]楊紹基．傳染病學(xué)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2002：112.

[5]彭文偉．傳染病學(xué)[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：132-134.

[6]楊書(shū)蘭，張奉學(xué)，朱宇同，等．用PCR法篩選先天感染鴨乙肝模型及后天感染模型的比較[J]．廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2001，18(3)：256-259．

[7]Lok AS，McMahon BJ．Chronic hepatitis B [J]．Hepatology．2007，45(2)：507-539．

[8]Ghany M，Liang TJ．Drug targets and molecular mechanisms of drug resistance in chronic hepatitis B [J]．Gastroenterology，2007，132：1574-85．