陳元巖，李天翔，謝明飛，石漢平，宋新民

(1.廣州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胃腸外科，廣東 廣州 510800；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃腸外科)

缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷是指各種病理情況下組織器官缺血一段時間后重新恢復(fù)血流，損傷卻進一步加重的現(xiàn)象[1]。能量代謝障礙、氧自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、微循環(huán)功能障礙及中性粒細(xì)胞活化并釋放炎性細(xì)胞因子為I/R損傷的主要發(fā)病機制[2]。近年來研究表明腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)是參與組織器官I/R損傷的重要細(xì)胞因子[3]，細(xì)胞凋亡[4]與組織器官I/R損傷有關(guān)。燈盞花主要分布于我國西南等省區(qū)，具有活血化瘀、改善微循環(huán)、通絡(luò)活絡(luò)、消炎止痛等功效[5]。本實驗研究燈盞花素對大鼠胰腺I/R損傷時血清中TNF-α、IL-1β的變化水平及胰腺組織中Survivin蛋白表達的影響，探討其在胰腺I/R中有無保護作用及其可能機制，為臨床防治胰腺I/R損傷提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組 遠(yuǎn)交群大鼠(SD大鼠)45只，由中山大學(xué)動物實驗中心提供，合格證號：scxk(粵)20080020，體重(220±20)g，雌雄不拘。隨機分為3組：假手術(shù)組(A組)、I/R組(B組)及燈盞花素組(C組)，各組大鼠15只，各組根據(jù)再灌注時間不同分為0、6、12 h三個時點，各時點大鼠5只，各組無死亡大鼠。

1.2 實驗試劑 大鼠TNF-α、IL-1β免疫試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，燈盞花素注射液(10 ml/支，批準(zhǔn)文號Z20040033，云南省玉溪制藥有限公司)，大鼠Survivin免疫組化試劑盒(美國Neomarkers公司)。

1.3 模型制備 所有實驗鼠術(shù)前禁食12 h，自由飲水，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定后取腹正中切口入腹，A組在開腹顯露腹腔干和腸系膜上動脈后不作阻斷；B組開腹顯露腹腔干和腸系膜上動脈，用無創(chuàng)血管夾阻斷腹腔干和腸系膜上動脈30 min后松開動脈夾進行再灌注，于再灌注前10 min經(jīng)尾靜脈推注生理鹽水5 ml/kg；C組按B組手術(shù)方法處理，于再灌注前10 min經(jīng)尾靜脈推注燈盞花素注射液4 mg/kg。操作過程中所有實驗動物腹腔內(nèi)注入37 ℃生理鹽水0.5 ml/kg，以保持血流動力學(xué)穩(wěn)定。

1.4 觀察指標(biāo) 各組實驗動物在再灌注0、6、12 h時立即腹主動脈采集血標(biāo)本約2 ml，2 000 r/min離心10 min，提取血清標(biāo)本，采用ELIS A方法測定血清TNF-α、IL-1β；具體步驟按試劑盒說明書進行。切取胰腺體尾部組織約1.0 cm×1.0 cm大小，固定于10%甲醛液中，常規(guī)病理切片，用于HE染色和免疫組化實驗。免疫組化采用SP染色法，具體步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行，陽性片由美國Neomarkers公司提供，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照。Survivin蛋白陽性染色細(xì)胞以細(xì)胞質(zhì)為棕黃色，400倍光鏡下觀察，每片隨機取5個視野，計算陽性與陰性細(xì)胞數(shù)，最后計算陽性百分率。細(xì)胞陽性染色≤10%為陰性表達，染色>10%為陽性表達。

2 結(jié)果

2.1 大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的變化 在再灌注0、6、12 h時，B、C組血清中TNF-α、IL-1β含量均較A組顯著升高(P<0.05)，但C組增高水平明顯低于B組(P<0.05)，見表1。

表1 各組不同時點TNF-α和IL-1β含量比較

注：與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

2.2 大鼠胰腺組織Survivin蛋白表達水平的變化 在再灌注0 h時，A、B、C三組胰腺組織Survivin蛋白表達水平比較組間差異無顯著性；在再灌注 6 h、12 h時C組胰腺組織Survivin蛋白表達較A、B組明顯增加(P<0.05)，但A、B兩組間差異無顯著性，見表2，圖1-2。

表2 各組不同時點Survivin蛋白表達水平的比較

注：與A組比較：1)P<0.05；與B組比較：2)P<0.05

2.3 組織形態(tài)學(xué)改變 光鏡下A、B組各時點未見明顯組織形態(tài)學(xué)改變；B組在再灌注0 h時見毛細(xì)血管擴張充血，炎性細(xì)胞浸潤；在再灌注6 h見灶狀壞死、核溶解；在再灌注12 h見片狀壞死。

圖1 Survivin蛋白在再灌注6 h I/R組胰腺組織中的表達(SP染色×400)

圖2 Survivin蛋白在再灌注6 h燈盞花素組胰腺組織中的表達(SP染色×400)

3 討論

引起胰腺I/R損傷的疾病臨床上常見于急性壞死性胰腺炎、腸系膜血管栓塞、胰腺移植、胰腺損傷以及休克等病理情況[6]。其發(fā)病機制復(fù)雜，其中最主要發(fā)病機制與能量代謝障礙、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、氧自由基的生成增多及及中性粒細(xì)胞激活并釋放炎性細(xì)胞因子等有關(guān)[7]。I/R時細(xì)胞內(nèi)Na+-K+-腺嘌呤核苷三磷酸(Na+-K+-adenosine triphosphate，Na+-K+-ATP)酶活性降低，膜通透性增加，ATP產(chǎn)生減少，大量Ca2+進入細(xì)胞內(nèi)，激活細(xì)胞膜上的蛋白酶和磷脂酶，破壞細(xì)胞膜的完整性，干擾線粒體的氧化磷酸化，導(dǎo)致能量代謝障礙，機體免疫功能受損，產(chǎn)生大量炎性細(xì)胞因子及氧自由基[8]，其中TNF-α和IL-1β是介導(dǎo)I/R損傷的主要細(xì)胞因子，本組實驗結(jié)果顯示：在再灌注0、6、12 h時，B組與C組TNF-α、IL-1β同A組相比明顯升高(P<0.05)，提示胰腺I/R后，炎性細(xì)胞因子起著非常重要的作用。

細(xì)胞凋亡是指為維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。是一種不同于細(xì)胞壞死的生理性、主動性死亡，又稱程序性細(xì)胞死亡[9]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，是目前發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子，該基因全長15 KB，定位于17q25，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子，其編碼產(chǎn)物為142個氨基酸組成的蛋白，分子量16.2 KD，可阻斷因氧自由基、輻射、缺血缺氧、抗腫瘤藥物等刺激引起的細(xì)胞凋亡[10]。

燈盞花素具有改善微循環(huán)，舒張血管，減低血管阻力，加快血流，紅細(xì)胞解聚，明顯降低血漿黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)及紅細(xì)胞比容，增加血流量，改善局部供血，抑制血小板積聚等功能[11，12]。此外，研究發(fā)現(xiàn)燈盞花素有較強的蛋白激酶C抑制作用[13]，以及能抑制氧化應(yīng)激和抑制細(xì)胞凋亡。從本實驗的結(jié)果來看，C組TNF-α、IL-1β增加的程度明顯低于B組(P<0.05)，同時組織病理學(xué)結(jié)果顯示：C組病理學(xué)改變較B組明顯減輕，說明燈盞花素在減輕大鼠胰腺I/R損傷方面有明顯的保護作用；C組Survivin蛋白表達較A組和B組明顯增加(P<0.05)，但A和B組之間差異無顯著性(P>0.05)，表明燈盞花素可以上調(diào)I/R損傷時胰腺細(xì)胞Survivin蛋白的表達，抑制細(xì)胞凋亡。綜上所述，燈盞花素對大鼠胰腺I/R損傷有保護作用，其機制可能上調(diào)Survivin蛋白表達有關(guān)，但其促使Survivin蛋白表達增強的具體機制尚不清楚，有待進一步研究。

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