張薇，趙杰，郭家駿，文志勇

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙410128；2.東方科技學(xué)院，湖南長沙410128）

栽培生理

馬鈴薯皮中黃酮類物質(zhì)測定及含量

張薇1*，趙杰1，郭家駿2，文志勇1

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，湖南長沙410128；2.東方科技學(xué)院，湖南長沙410128）

以馬鈴薯皮為試驗材料，研究了黃酮類化合物提取方法，獲得了提取馬鈴薯皮中黃酮類化合物的最佳條件,測量了馬鈴薯皮中體現(xiàn)抗氧化性的黃酮類化合物的含量。試驗中，對馬鈴薯皮中黃酮類化合物進行了提取、分離，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl，DPPH）的清除率作為馬鈴薯皮中提取的黃酮類化合物含量及抗氧化活性的評價指標(biāo)。通過單因素試驗，確定提取溶劑、溫度、時間、料液比等對提取結(jié)果的影響程度。并在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計4因素3水平的正交試驗，從而確定馬鈴薯皮中黃酮類化合物的最佳提取條件。結(jié)果表明，馬鈴薯皮中黃酮類抗氧化物的提取最佳條件為50℃的溫度下用80%丙酮溶液按照料液比1∶10的比例提取，提取時間為3 h。在此條件下測得DPPH的清除率為84.62%。在最佳提取條件下提取馬鈴薯皮中黃酮類化合物，并測得每克烘干后的馬鈴薯皮中含有約10.95 mg的黃酮類物質(zhì)，與其它類果實果皮中具有相似的抗氧化活性的黃酮類物質(zhì)的含量相比明顯較高。

馬鈴薯皮；DPPH；黃酮類；提取方法；抗氧化物質(zhì)

馬鈴薯皮中含有豐富的抗氧化物質(zhì)。其中抗氧化物質(zhì)主要為黃酮類、多酚類和原花青素等，其中主要的抗氧化物質(zhì)為黃酮類抗氧化物質(zhì)，它是一種天然的抗氧化劑，對人體具有抗腫瘤、延緩衰老、增強心血管功能，能治療慢性前列腺炎，增強免疫力，調(diào)解內(nèi)分泌系統(tǒng)，并有護肝、抗炎、抗過敏、抑菌、抗病毒等重要的生理保健功效[1-14]。是廣泛用于生物制藥工業(yè)的廉價天然抗氧化劑，可取代部分目前常用的合成抗氧化劑。若是將皮中的黃酮類物質(zhì)加以開發(fā)和利用，不但可以減少資源的浪費，還可以為馬鈴薯的加工業(yè)提供新的出路。

本研究主要進行馬鈴薯皮中黃酮類化合物提取、分離、測定及其抗氧化活性的測定。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以溶劑濃度、提取溫度、料液比、提取時間為因素，通過正交試驗確定馬鈴薯皮中黃酮類化合物提取的最佳條件，用丙酮溶液對馬鈴薯皮中的黃酮類化合物進行提取,用聚酰胺柱層析法對其進行分離和純化，用紫外可見分光光度法進行定性定量分析，獲得馬鈴薯皮中黃酮類化合物的含量。馬鈴薯皮中黃酮類化合物抗氧化測試，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl，DPPH）的清除率作為馬鈴薯中黃酮類化合物抗氧化活性的評價指標(biāo)進行抗氧化活性測定。本研究為實現(xiàn)對馬鈴薯皮中黃酮類化合物深度開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化研究打下基礎(chǔ)，將產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟效益。黃酮類化合物的研究還需要關(guān)注生物利用度、代謝動力學(xué)、體內(nèi)的氧化損傷、長期服用產(chǎn)生的慢性后果等。本研究為開發(fā)出可靠的、令人信服的系統(tǒng)以精確評估其在人體內(nèi)的代謝作用是十分必要的。因此，研究馬鈴薯皮中抗氧化物質(zhì)具有重要的意義和廣闊的發(fā)展前景。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯塊莖購自湖南省長沙市馬王堆菜市場。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：UV-2100紫外分光光度計（德國萊伯泰科（北京）有限公司）。

主要試劑：蘆?。?biāo)樣，AR，湖南省藥品檢驗局）、DPPH（AR，美國Sigma公司）、無水乙醇（AR）、丙酮（AR）、甲醇（AR）、氫氧化鈉（AR）、亞硝酸鈉（AR）、九水硝酸鋁（AR）、聚酰胺樹脂等。

5%亞硝酸鈉的制備：取0.535 g的99%亞硝酸鈉，加入10 mL蒸餾水制得。

10%硝酸鋁的制備：取2.175 g的99%九水硝酸鋁，加入10 mL蒸餾水制得。

10%氫氧化鈉的制備：取11.554 g的96%氫氧化鈉，加入100 mL蒸餾水制得。

1.3 方法

1.3.1 馬鈴薯皮黃酮類物質(zhì)提取

取馬鈴薯塊莖皮（厚2 mm）22 g，切塊，破碎，稱取10 g于三角瓶中，然后用80%丙酮溶液于50℃下浸提黃酮類物質(zhì)，提取3 h，再于50℃下超聲波提取30 min后，過濾，濾液在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至約23 mL，用200 mL水溶解上聚酰胺柱，先用5倍柱體積的水洗脫，棄去，再用60%的乙醇溶液5倍體積進行洗脫，收集并濃縮至干，得馬鈴薯皮總黃酮粗樣品。

1.3.2 抗氧化試驗

DPPH分子式C18H12N5O6，分子量394.32，是暗紫色大棱柱形晶體。DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，在517 nm處有一強吸收，其乙醇溶液呈深紫色。當(dāng)有自由基清除劑存在時，由于與其單電子配對而使其吸收逐漸消失，其褪色程度與其接受的電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可用分光光度法進行定量分析。以對DPPH的清除率作為馬鈴薯提取物抗氧化活性的評價指標(biāo)。DPPH清除率的計算：

式中（DPPH）t：t時刻體系中DPPH的濃度；（DPPH）0：0時刻體系中DPPH的起始濃度。

DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：準(zhǔn)確稱取DPPH 0.0075 g用甲醇定容至10 mL的容量瓶中，得濃度為0.75 mg/mL的DPPH溶液。分別移取0.40，0.80，1.20，1.60，2.00和2.40 mL濃度為0.75 mg/mL的DPPH溶液，用甲醇溶解定容至100 mL，得濃度為0.003（1號），0.006（2號），0.009（3號），0.012（4號），0.015（5號）和0.018 mg/mL（6號）DPPH溶液。在517 nm處分別測吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，得出其回歸方程為y=26.324x+0.0076，r2=0.9998。

分別對不同提取溶劑、不同提取溫度、不同提取時間、不同料液比和不同提取次數(shù)提取得到的抗氧化物質(zhì)進行清除DPPH的活性測定。以對DPPH的清除率作為馬鈴薯提取物抗氧化活性的評價指標(biāo)。

馬鈴薯皮中抗氧化物質(zhì)提取正交試驗在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以溶劑濃度、提取溫度、料液比、提取時間為因素，DPPH的清除率為指標(biāo)，正交試驗確定馬鈴薯中抗氧化物質(zhì)提取的最佳組合。

1.3.3 黃酮類物質(zhì)含量的測定

圖1 DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 DPPH standard curve

黃酮類化合物廣泛存在于生物界，分子中含有酚羥基及吡喃酮環(huán)，由于這些結(jié)構(gòu)單元，使得黃酮類化合物可以與鋁鹽、鉛鹽、鎂鹽、鋯鹽等試劑反應(yīng)，產(chǎn)生有色絡(luò)合物，可采用紫外可見分光光度法定性定量測定黃酮類化合物。本試驗在最佳提取方案下提取馬鈴薯皮中黃酮類化合物，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣品，用紫外可見分光光度法測出馬鈴薯皮中黃酮類物質(zhì)的含量。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)樣0.0120 g用95%乙醇溶液溶解后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，定容，搖勻，得對照試液B。準(zhǔn)確吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL，分別置于10 mL的容量瓶中加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，混勻，放置6 min加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%氫氧化鈉溶液4 mL，用蒸餾水定容至刻度（濃度分別為0.000，0.012，0.024，0.036，0.048和0.060 mg/mL），搖勻，靜置15 min后，在波長513 nm處測吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，得出其回歸方程為：y=10.275 x-0.0471，r2=0.9931

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品抗氧化活性測定

稱取0.0060 g DPPH用甲醇溶解定容至250 mL的容量瓶中的，得濃度為0.024 mg/mL的溶液。取樣品0.0097 g用甲醇溶解，過濾，將濾液用甲醇定容至10 mL。取樣品的甲醇溶液0.2 mL，加入7.8 mL濃度為0.024 mg/mL DPPH甲醇溶液，立即混勻，用分光光度計于517 nm處測定吸光度，分別測定0 min和5 min時的吸光度，其后每隔15 min測一次吸光度直到讀數(shù)穩(wěn)定為止（表1）。

圖2 蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Rutin standard curve

表1 在不同時間段測得DPPH的濃度和吸光度Table 1 Concentration and absorbance of DPPH measured at different times

測定結(jié)果表明，在0～20 min測定較好。

2.2 提取液的選擇

按表2、表3進行提取液的選擇試驗。

測定結(jié)果表明，用不同的提取液DPPH清除率不同，用80%丙酮提取時DPPH清除率最大。

2.3 溫度的選擇

按表4、表5進行提取溫度的選擇試驗。

測定結(jié)果表明，隨著溫度變化DPPH清除率在變化，溫度60～80℃時DPPH清除率達最大。

2.4 時間的選擇

按表6、表7進行提取時間的選擇試驗。

測定結(jié)果表明，用不同的提取時間DPPH清除率不同，用80%丙酮提取2 h DPPH清除率最大。

2.5 料液比的選擇

按表8、表9進行提取料液比的選擇試驗。

表2 提取液的選擇Table 2 Extract selection

表3 不同提取液在不同時間段測得DPPH的濃度和吸光度Table 3 Concentration and absorbance of DPPH for different extracts measured at different times

測定結(jié)果表明，用不同的料液比提取DPPH清除率不同，用80%丙酮料液比為1：20或1：25提取時間2 h DPPH清除率最大。

2.6 提取次數(shù)的選擇

按表10、表11進行提取次數(shù)的選擇試驗。

測定結(jié)果表明，不同的提取次數(shù)DPPH清除率變化不大。

2.7 正交試驗

在考查了各單因素對馬鈴薯皮提取物抗氧化性影響的基礎(chǔ)上，為了找出各工藝參數(shù)的最佳組合，設(shè)計了四因素三水平的正交試驗（表12）。

根據(jù)正交試驗確定最佳提取條件為A3B2C1D3，即用80%丙酮、溫度50℃、料液比1:10下提取3 h（表13）。

表4 溫度的選擇Table 4 Temperature selection

表5 不同溫度在不同時間段測得DPPH的濃度和吸光度Table 5 Concentration and absorbance of the DPPH for different temperatures measured at different times

表6 時間的選擇Table 6 Time selection

表7 不同提取時間在不同時間段測得DPPH的濃度和吸光度Table 7 Concentration and absorbance of the DPPH for different extraction times measured at different times

表8 料液比的選擇Table 8 Solid-liquid ratio selection

表9 不同料液比在不同時間段測得DPPH的濃度和吸光度Table 9 Concentration and absorbance of DPPH for different soid-liquid ratios measured at different times

續(xù)表9：

表10 提取次數(shù)的選擇Table 10 Extraction times selection

表11 不同提取次數(shù)在不同時間段測得DPPH的濃度和吸光度Table 11 Concentration and absorbance of DPPH for different extraction times measured at different times

2.8 馬鈴薯皮中黃酮類物質(zhì)含量的測定

2.8.1 馬鈴薯皮中黃酮類物質(zhì)的提取

取烘干后的馬鈴薯皮10.058 g，用100.037 mL的80%丙酮，在溫度50℃的條件下超聲提取3 h后過濾。將濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋干后，再用95%的乙醇溶液定容到250 mL的容量瓶中。得備用液A。

2.8.2總黃酮含量的測定

準(zhǔn)確吸取3.00 mL馬鈴薯提取液A于10 mL容量瓶，加蒸餾水至刻度線。分別精確量取2.00 mL，于3個10 mL容量瓶中，分別再加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，混勻，放置6 min加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，放置6 min，加入10%氫氧化鈉溶液4 mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，靜置15 min，在513nm處測定吸光度。測得1號濃度為0.018 mg/ mL，吸光度為0.134；2號濃度為0.017 mg/mL，吸光度為0.132；3號濃度為0.019 mg/mL，吸光度為0.147。平均濃度為0.018 mg/mL。每克烘干后的馬鈴薯皮中含有10.95 mg的黃酮類物質(zhì)。

3 討論

本試驗通過單因素試驗和正交試驗，確定了馬鈴薯皮中抗氧化物提取的最佳工藝。最佳工藝為在50℃下用80%丙酮溶液按照料液比1：10的比例提取時間3 h，并在此條件下測得DPPH的清除率為84.62%。在最佳提取條件下提取馬鈴薯皮中的黃酮類物質(zhì)，測得每克烘干后的馬鈴薯皮中含有10.95 mg的黃酮類物質(zhì)。較蘋果皮中的黃酮類物質(zhì)的含量1.884 mg/g要高很多，根據(jù)其抗氧化性，說明提取馬鈴薯中的黃酮類物質(zhì)更有實用價值。而且較蘋果皮中的抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力也要高很多[14]。

表12 正交試驗因素水平Table 12 Factors and levels in an orthogonal experiment

表13 正交試驗結(jié)果和極差分析Table 13 Results and range analysis of orthogonal experiment

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Determination and Content of Flavonoids in Potato Peel

ZHANG Wei1＊,ZHAO Jie1,GUO Jiajun2,WEN Zhiyong1

The procedure for flavonoid extraction from potato peel was studied and optimal conditions determined using potato as experimental material.In the experiment,flavonoids in potato peel was extracted,separated,and evaluated by clearance of 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl)hydrazyl(DPPH).Through single factor experiments,extraction efficiency was studied under different extraction solvents,temperatures,times,as well as the ratios of solid to liquid.An orthogonal experiment was designed based on changes in 4 factors and 3 levels to determine the best conditions forflavonoid extraction in potato peel.The experimentshowed thatextracted flavonoids in potato peelin 80%acetone solution with the ratio of 1：10 of solid to liquid at 50°C for 3 h could get the ideal result.Under these conditions,the DPPH clearance rate was 84.62%and the contentofflavonoids in dried potato peelwas 10.95 mg/g DW.Potato peelcontained higher flavonoids than otherfruitpeels whichhas a similarantioxidantactivity.

potato peel;DPPH;flavonoid;extraction approach;antioxidant

S532

B

1672－3635（2013）05-0265-08

2013-10-16

湖南省科學(xué)技術(shù)廳科技計劃項目（2012NK3083）。

張薇（1962-），女，教授，主要從事應(yīng)用化學(xué)研究。

張薇，E-mail:zhangwei6261@hotmail.com。

(1.College of Science,Hunan Agricultural University,Changsha,Hunan 410128,China; 2.Oriental Institute of Science and Technology,Changsha,Hunan 410128,China)