文義凱，劉柏林,，盧蔚雯，張寧，司懷軍,*，王蒂

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省干旱生境作物學(xué)省部共建國家重點實驗室培育基地，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州730070）

栽培生理

馬鈴薯塊莖休眠解除過程的形態(tài)學(xué)觀察與鑒定

文義凱1，劉柏林1,2，盧蔚雯1，張寧1，司懷軍1,2*，王蒂2

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州730070；2.甘肅省干旱生境作物學(xué)省部共建國家重點實驗室培育基地，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，甘肅蘭州730070）

利用石蠟切片分析了室溫儲存條件下馬鈴薯栽培品種‘Favorita’塊莖休眠解除過程中的形態(tài)組織學(xué)變化，并對塊莖中的淀粉和蛋白質(zhì)含量的變化作了研究。結(jié)果顯示，馬鈴薯塊莖在休眠期芽眼分生組織細(xì)胞停止分裂，伴隨著休眠的解除，芽眼分生組織細(xì)胞開始分裂且分裂速度越來越快，芽原基最終形成一個完整的芽，伴隨此過程，觀察到芽原基周圍部分細(xì)胞程序性死亡最終發(fā)育形成環(huán)紋、螺紋導(dǎo)管的現(xiàn)象；馬鈴薯塊莖從休眠解除到芽的萌發(fā)過程中淀粉含量則出現(xiàn)下降且淀粉顆粒逐漸由規(guī)則卵圓形變?yōu)檩^小的不規(guī)則狀，在靠近芽原基的分化部位蛋白質(zhì)含量有明顯上升趨勢。室溫儲存60 d的塊莖被認(rèn)為完全解除休眠。

馬鈴薯；塊莖；休眠；組織學(xué)；細(xì)胞學(xué)

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是世界第四大糧食作物，又是重要的蔬菜作物和食品及工業(yè)加工原料[1]。馬鈴薯塊莖的休眠與發(fā)芽對于馬鈴薯的種植栽培以及生產(chǎn)加工極為重要[2]。馬鈴薯種植栽培中，塊莖的休眠程度對其出苗率、整齊度和產(chǎn)量均有影響，生產(chǎn)加工上塊莖的休眠程度影響著馬鈴薯的運輸儲藏以及商品質(zhì)量和應(yīng)用價值[3,4]。由于對馬鈴薯塊莖休眠機(jī)理了解的欠缺，人工調(diào)控技術(shù)發(fā)展緩慢[5]，嚴(yán)重制約了馬鈴薯種薯生產(chǎn)的發(fā)展和塊莖作為工業(yè)加工原料的充分利用。因此，對馬鈴薯塊莖休眠與發(fā)芽的研究顯得越來越迫切。研究馬鈴薯塊莖休眠機(jī)理，對馬鈴薯栽培和儲藏保鮮等方面也具有很重要的意義[6]。休眠與發(fā)芽是馬鈴薯塊莖生長發(fā)育過程中的一個階段，馬鈴薯塊莖成熟收獲至發(fā)芽的過程中，芽眼分生組織發(fā)生一系列的形態(tài)改變。確定塊莖可見芽萌發(fā)前的形態(tài)變化，對于鑒定塊莖休眠解除所需時間具有重要意義。本試驗對馬鈴薯塊莖在休眠解除過程中的形態(tài)組織學(xué)變化以及淀粉和蛋白質(zhì)含量變化進(jìn)行了研究，利用顯微技術(shù)來判斷塊莖休眠解除所需要的具體時間。為進(jìn)一步研究休眠的內(nèi)部機(jī)理，探索工業(yè)化控制馬鈴薯塊莖休眠的技術(shù)，提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料來源

馬鈴薯栽培品種‘Favorita’試管苗由甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室提供。

1.1.2 材料的固定與保存

馬鈴薯微型薯由甘肅省渭源縣田源澤馬鈴薯良種專業(yè)合作社生產(chǎn)。試管苗于2011年7月移栽至溫度（22±2）℃、相對濕度60%~70%溫室培養(yǎng)，2011年10月收獲大小均勻、成熟度一致、重量（3±0.5）g的薯塊，室溫放置15 d后于黑暗（20±2）℃條件下進(jìn)行儲藏試驗，每隔5 d，取形態(tài)一致的微型薯3個，采用單面刀片縱切帶有芽眼的塊莖，置于FAA固定液中固定保存。該處理步驟一直持續(xù)到種薯的芽長至5 cm為止。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫水、透明、浸蠟和包埋

（1）脫水：將用FAA固定液固定好的材料分別在30%、50%、70%、83%、95%和100%各級酒精中進(jìn)行處理，各自處理2 h，以使材料脫去水分變硬而容易與石蠟更好的融合。

（2）透明：透明劑為二甲苯，先用1/2二甲苯進(jìn)行過渡處理2 h，再用純二甲苯處理2 h，以除去在脫水過程浸入的酒精，利于下一步的浸蠟和包埋。

（3）浸蠟：將材料中的二甲苯倒出，留下大約3/4體積，再在石蠟：酒精為3：2的混合液體中在37℃下處理3 d。在56～60℃的恒溫箱中用100%的石蠟連續(xù)處理3次，時間分別為1 h。

（4）包埋：用100%的石蠟將處理后的材料包埋于特制小盒中，以備切片。

1.2.2 切片及染色

（1）切片：將修好的蠟塊用單面刀片修整好，經(jīng)旋轉(zhuǎn)切片機(jī)切片，切片厚度10 μm。將其固定于涂有梅氏蛋清液的載玻片上待用。

（2）脫蠟：用兩組染色缸分別對切片進(jìn)行脫蠟和復(fù)水。脫蠟采用1/2二甲苯和二甲苯處理5 min,然后將脫蠟后的切片經(jīng)各級濃度酒精逐漸下降到水。

（3）染色：組織形態(tài)學(xué)觀察采用番紅-固綠二重染色。PAS法做淀粉的組織化學(xué)染色，汞-溴酚藍(lán)法做蛋白質(zhì)的組織化學(xué)染色。

（4）石蠟切片的封藏及顯微照相：將完成染色的石蠟切片用加拿大樹膠封藏并整理好，并在Motic745型數(shù)碼顯微鏡下觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)組織學(xué)變化分析

收獲后室溫儲藏15 d的休眠塊莖（圖1），由外向內(nèi)的結(jié)構(gòu)依次是周皮、表皮、皮層、維管束環(huán)和髓部。最外層為周皮，其下2～3層細(xì)胞體積較小，形狀不規(guī)則，排列緊密而彼此鑲嵌，為表皮細(xì)胞。表皮細(xì)胞中未觀察到淀粉粒。皮層薄壁組織細(xì)胞和髓薄壁組織細(xì)胞體積較大，近圓形，細(xì)胞壁薄含有豐富的淀粉顆粒。維管束環(huán)3～4層細(xì)胞將皮層和髓部分開，其間的薄壁細(xì)胞不含淀粉粒。芽眼里的芽呈扁平狀，分生組織沒有細(xì)胞分裂的發(fā)生（圖2）。儲藏45 d后，塊莖頂端分生組織細(xì)胞開始分裂，說明塊莖休眠打破，芽眼開始萌動（圖3）。頂端原始芽位于表皮層中央，細(xì)胞具有液泡，細(xì)胞核大，但核仁不明顯，其下為亞頂端原始細(xì)胞，細(xì)胞略成團(tuán)排列，核仁明顯。肋狀分生組織細(xì)胞5～6列細(xì)胞位于亞頂端原始細(xì)胞下，細(xì)胞較大且排列有序，其液泡化程度較大。周緣分生組織細(xì)胞沿頂端外形輪廓排列，細(xì)胞相對于肋狀分生組織細(xì)胞為小，但同樣排列有序且緊密。芽生長錐由扁平開始凸起（圖3），肋狀分生組織細(xì)胞由上向下呈明顯的細(xì)胞下移位現(xiàn)象，并劃分出一定的區(qū)域梯度。由上向下，細(xì)胞首先變得愈狹長，細(xì)胞核越小。15 d之后，當(dāng)轉(zhuǎn)到快速分裂期時，細(xì)胞漸趨矩形。隨著細(xì)胞分裂的加快，細(xì)胞體積增大，分化葉原基凸起，當(dāng)休眠期通過時，生長錐變成半球狀，最后形成芽（圖4）。在馬鈴薯塊莖儲藏60～65 d左右細(xì)胞分裂速度可能達(dá)到最大值，這時的芽開始快速生長（圖5），肉眼可見芽出現(xiàn)，塊莖休眠完全解除。在塊莖休眠解除初期（儲藏45 d后），皮層薄壁組織細(xì)胞在接近維管束環(huán)處的部分細(xì)胞細(xì)胞核變大，細(xì)胞質(zhì)變濃（圖6），隨著芽原基持續(xù)分化，核仁消失，細(xì)胞伸長，分化成管狀分子（圖7），塊莖芽形成之時，這些管狀分子與旁側(cè)毗鄰管狀分子相連，其壁呈環(huán)紋或螺紋加厚，形成導(dǎo)管（圖8）。導(dǎo)管分子的分化以維管束環(huán)開始，伸入芽中。整個過程中未觀察到篩管分化。

圖1 儲存15 d馬鈴薯塊莖橫切（×10）Figure 1 Tuber cross section after 15 d storage（×10）

圖2 儲存15 d芽的變化（×10）Figure 2 Bud growth change after 15 d storage（×10）

圖3 儲存45 d芽的變化（×10）Figure 3 Bud growth change after 45 d storage（×10）

圖4 儲存60 d芽的變化（×10）Figure 4 Bud growth change after 60 d storage（×10）

圖5 儲存65 d芽的變化（×10）Figure 5 Bud growth change after 65 d storage（×10）

圖6 儲存45 d導(dǎo)管形態(tài)（×10）Figure 6 Tuber vessel shape after 45 d storage（×10）

圖7 儲存60 d導(dǎo)管形態(tài)（×10）Figure 7 Tuber vessel shape after 60 d storage（×10）

圖8 儲存65 d導(dǎo)管形態(tài)（×10）Figure 8 Tuber vessel shape after 65 d storage（×10）

2.2 淀粉和蛋白質(zhì)分布及其消長動態(tài)

在進(jìn)入到馬鈴薯塊莖休眠解除過程中，淀粉和蛋白質(zhì)的分布和含量會發(fā)生一系列的變化。此變化特征與馬鈴薯塊莖芽萌發(fā)的解剖特征相一致。

圖9 儲存15 d淀粉顆粒分布（×40）Figure 9The distribution of starch granules after 15 d storage（×40）圖10 儲存15 d淀粉顆粒和蛋白質(zhì)分布（×40）Figure 10The distribution of starch granules and protein after 15 d storage（×40）

圖11 儲存45 d淀粉顆粒和蛋白質(zhì)分布（×40）Figure 11The distribution of starch granules and protein after 45 d storage（×40）圖12 儲存45 d淀粉顆粒、蛋白質(zhì)和導(dǎo)管分布（×40）Figure 12The distribution of starch granules,protein and vessel after 45 d storage（×40）

圖13 儲存60 d蛋白質(zhì)分布（×40）Figure 13Thedistributionofproteinafter60dstorage（×40）圖14 儲存60 d淀粉顆粒分布（×40）Figure 14The distribution of starch granules after 60 d storage（×40）

從儲藏15 d的休眠塊莖中可以看到被染成紫紅色的淀粉粒大小一致，呈均勻的圓形或卵圓形，在皮層和髓部的薄壁組織細(xì)胞中均勻分布著。近芽眼端的皮層薄壁組織細(xì)胞中，淀粉顆粒均勻地圍繞著細(xì)胞核，含量一致。塊莖中的被染成藍(lán)色的蛋白質(zhì)含量極為稀少（圖9，圖10）。儲藏45 d的馬鈴薯塊莖中，伴隨著芽萌發(fā)的開始，近芽眼端的皮層薄壁組織細(xì)胞中，淀粉顆粒明顯變少變小，形狀也由圓形和卵圓形變得較為不規(guī)則，馬鈴薯塊莖蛋白質(zhì)的含量也相應(yīng)的增加。在細(xì)胞核周圍出現(xiàn)較多藍(lán)色蛋白質(zhì)，部分細(xì)胞中甚至已不存在淀粉粒，表明淀粉顆粒在不斷的分解消耗。在皮層薄壁組織部分細(xì)胞脫分化形成導(dǎo)管分子時，其原生質(zhì)中已經(jīng)完全沒有淀粉粒（圖11，圖12）。當(dāng)儲存至60 d時，由于在芽的萌發(fā)過程中，芽眼附近分生組織細(xì)胞分裂迅速，需要大量的核酸和蛋白質(zhì)以及其它的一些營養(yǎng)物質(zhì)，在芽眼附近這種轉(zhuǎn)化趨勢更加明顯，淀粉分布及消長動態(tài)體現(xiàn)明顯的極性。從髓薄壁組織細(xì)胞到皮層薄壁組織細(xì)胞淀粉粒數(shù)量由多到少，體積由大變小，形狀變得不規(guī)則，呈梯度分布。接近芽和維管束的薄壁組織細(xì)胞中已不含淀粉粒（圖13，圖14）。

3 討論

3.1 馬鈴薯塊莖芽原基的分化和發(fā)育

試驗結(jié)果表明，馬鈴薯塊莖自收獲之日起整個組織的細(xì)胞分裂以及物質(zhì)合成等一系列生命活動并非完全停止，而是一些基因處于被抑制狀態(tài)，組織的代謝水平也處于一個比較低的水平但生命活動仍在進(jìn)行并非停止。當(dāng)休眠開始打破芽開始萌發(fā)時，馬鈴薯塊莖芽眼處的頂端分生組織細(xì)胞開始分裂，芽生長錐由扁平開始突起，分生組織細(xì)胞不但出現(xiàn)由上向下位移的位置變化，而且出現(xiàn)了細(xì)胞形態(tài)的變化，首先是細(xì)胞由上向下變得愈來愈狹長，之后逐漸趨于矩形，直到幼芽的形成。隨著馬鈴薯塊莖芽眼處的頂端分生組織細(xì)胞開始分裂，皮層薄壁組織細(xì)胞部分細(xì)胞經(jīng)過脫分化及細(xì)胞程序性死亡過程，構(gòu)成了環(huán)紋導(dǎo)管和螺紋導(dǎo)管。已知環(huán)紋導(dǎo)管和螺紋導(dǎo)管直徑較小，輸水能力較弱，多在器官早起生長過程中出現(xiàn)，本試驗的觀察結(jié)果恰好證實了這一點。由試驗觀察表明，馬鈴薯塊莖側(cè)芽發(fā)生后韌皮部退化、木質(zhì)部發(fā)達(dá)，因此推測馬鈴薯塊莖側(cè)芽發(fā)生初期主要從皮層和髓部攝取水分和無機(jī)營養(yǎng)。

3.2 馬鈴薯塊莖芽原基的分化和發(fā)育過程中淀粉和蛋白質(zhì)的變化動態(tài)

馬鈴薯塊莖從休眠到芽的萌發(fā)過程中，各種儲藏物質(zhì)發(fā)生變化，其中淀粉不斷地降解成還原性糖，所以淀粉含量在休眠打破的整個過程中都在不斷下降[7]。由于馬鈴薯塊莖在休眠狀態(tài)下細(xì)胞分裂停止，細(xì)胞代謝比較緩慢，蛋白質(zhì)的合成也處于一個比較低的水平，所以在這個過程當(dāng)中，淀粉含量基本上沒什么變化，但是當(dāng)休眠解除，芽開始萌發(fā)時，細(xì)胞分裂顯著加快，代謝也明顯加快，這時需要合成大量的核酸和蛋白質(zhì)以及一些其他的大分子物質(zhì)。在芽的萌發(fā)過程中，特別是在芽眼附近由于需要大量的蛋白質(zhì)這種趨勢尤為明顯。在芽的萌發(fā)過程中，也需要大量的能量，這些能量都需要馬鈴薯的塊莖提供，主要是靠糖類的降解來提供，結(jié)果導(dǎo)致淀粉因降解在塊莖中的含量不斷變少。試驗結(jié)果顯示，馬鈴薯塊莖中的淀粉顆粒主要儲藏在皮層和髓部的薄壁組織細(xì)胞中，在芽的萌發(fā)過程中，淀粉粒在靠近芽眼的部位明顯減少且淀粉粒大小呈現(xiàn)出明顯變小和形態(tài)變得不規(guī)則的趨勢。馬鈴薯塊莖在休眠解除過程中，蛋白質(zhì)的分布和積累趨勢與淀粉的相反。在皮層和髓部的薄壁組織細(xì)胞中積累了大量淀粉，芽原基分生組織細(xì)胞和維管束環(huán)細(xì)胞中卻不含淀粉粒，而是逐漸積累了豐富的蛋白質(zhì)。

[1]魏延安.世界馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及特點[J].世界農(nóng)業(yè),2005 (3):29-32.

[2]高志勇.馬鈴薯轉(zhuǎn)基因工程研究進(jìn)展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37 (1):18-20.

[3]張麗莉,陳伊里,連勇.馬鈴薯塊莖休眠及休眠調(diào)控研究進(jìn)展[J].中國馬鈴薯,2003,17(6):32-38.

[4]蒲建剛,孫林祥,裴建文,等.脫毒馬鈴薯微型薯原原種打破休眠試驗研究初報[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技,1999(7):13-15.

[5]司懷軍,張寧,王蒂.馬鈴薯塊莖休眠和發(fā)芽的分子機(jī)理及調(diào)控策略[J].中國馬鈴薯,2007,21(2):104-107.

[6]王鵬.馬鈴薯離體塊莖休眠生理研究[D].中國農(nóng)科院,2001.

[7]Loon C D van.The effect of a cold shock on dormancy of potatoes[J]. Potato Research,1983,26(1):79-81.

Observation and Identification of Potato Morphological Changes during Tuber Dormancy Release

WEN Yikai1,LIU Bailin1,2,LU Weiwen1,ZHANG Ning1,SI Huaijun1,2＊,WANG Di2
(1.College of Life Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070,China; 2.Gansu Provincial Key Laboratory of Aridland Crop Science,Gansu Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070,China)

The changes in histology,and starch and protein content of potato variety'Favorita'tuber dormancy breaking process were investigated by paraffin section methods.The results showed that tuber eye meristematic tissue cells stopped dividing in dormancy state and started dividing rapidly along with dormancy breaking.Finally,a bud was formed gradually by bud primordium.The partialprogrammed celldeath around bud primordium eventually formed annularvesseland spiralvessel.The content of starch decreased,and ovoid starch granule changed into small irregular one.The protein content increased dramatically around bud primordium during the period of tuber dormancy breaking to sprouting.It is considered that tuber dormancy break completely 60 days afterstorage atroomtemperature.

Solanum tuberosum L.;tuber;dormancy;histology;cytology

S532

A

1672－3635（2013）01-0014-05

2012-07-19

國家自然科學(xué)基金項目（30871573和31160298）。

文義凱（1984-），男，碩士，教輔，從事馬鈴薯遺傳育種研究。

司懷軍，博士，教授，主要從事馬鈴薯生物技術(shù)和分子生物學(xué)研究，E-mail:hjsi@gsau.edu.cn。