田野 李毅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學，甘肅 蘭州 730070）

0 前言

1）大花萱草無性繁殖技術研究狀況

（1）大花萱草簡介

大花萱草根分為肉質根和須根，肉質根呈紡錘狀，須根多生長在肉質根上。具短根狀莖，葉翠綠狹長，基生呈帶狀排成兩列?；ㄌ闹胁砍槌觯菪隣罹蹅慊ㄐ?，每個花絮可著花數(shù)十朵?；ɡ偎启?，開如漏斗，裂片翻卷，為百合形花冠，花瓣先端裂開?；ū换亢仙释矤?，雄蕊6枚，3長3短，花藥呈丁字形背著在花絲頂端，除藍色和純白色以外其余花色均有栽培品種?；◤阶兓螅ㄐ胃鳟?，花期從晚春一直到秋季。大多數(shù)品種的花只開一天，但盛花期可以延續(xù)幾周甚至幾個月，有些品種單花壽命可超過24小時。蒴果，黑褐色、多棱形、有光澤，自然結實率低，但大部分品種不結實。

大花萱草抗旱能力強，耐高溫，抗低寒，適應溫度范圍廣，在我國從南到北均可種植。抗病性強，對土壤的適應性廣，除過酸、過堿、過沙、過粘的土壤外一般都能栽培，PH值以6.5至7.5之間為好。

該類花卉對堿性土具有特別的耐性，是油田及灘涂地帶不可多得的綠化材料?？捎脕聿贾酶魇交▔ⅠR路隔離帶、疏林草坡等。亦可利用其矮生特性做地被植物。其中有數(shù)個品種為“冬青”型，種植在南國，可四季常綠，是優(yōu)秀的園林綠地花卉。

（2）繁殖方法

分株分割萱草叢塊是最常用的繁殖方法。該方法操作簡單，植株容易存活，長勢比較一致。分株可將母株叢全部挖出，重新分栽；或者是由母株叢一側挖出一部分植株做種苗，留下的繼續(xù)生長。

分株多在春季萌芽前或秋季落葉后進行。春季分株移栽，當年即可抽苔開花；秋季分株移栽，翌年才能抽苔開花。移栽時應選用生長旺盛、花蕾多、品質好、無病蟲害的植株。

分株時挖取株叢的一部分分蘗作為種苗，挖取部分要帶根，從短縮莖處割開，將老根、朽根和病根剪除，盡量保留肉質根，適當剪短（約留10厘米）后即可栽植。栽植應選在晴天進行，邊挖苗，邊分苗，邊栽苗，盡量少傷根，這樣緩苗快。一般2-3年分株一次，以保證植株旺盛的生長勢。

組培用幼嫩葉片、花絲和花苔等器官培養(yǎng)成植株。方法是先誘導幼嫩器官產(chǎn)生愈傷組織，然后用適當培養(yǎng)基在適宜的溫濕光氣等條件下培養(yǎng)成幼小植株。再將小苗假植于營養(yǎng)缽，經(jīng)一段時間培養(yǎng)成植株幼苗，之后定植。但這種方法還沒有被廣泛接受。

植物的組織培養(yǎng)是利用無性生殖原理，使植物組織在人工控制的條件下，通過細胞的增殖和分化，快速發(fā)育成新植株的高新技術手段。近年來，隨著科學技術的迅猛發(fā)展，植物組織培養(yǎng)技術已進入生產(chǎn)應用階段。利用這種技術，可以將植物的莖尖、葉片、莖段等切成小片，或用花藥、花粉等在無菌條件下，在玻璃器皿中人工配制的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使它們發(fā)育成完整的植物體。利用植物組織培養(yǎng)的方法，只需要用少量植物材料，就可以在短期內誘導出大量“試管苗”。

這種方法不僅繁殖速度快，受季節(jié)影響小，而且誘導變異也比較容易，為科研和生產(chǎn)帶來了很大方便。此外，由于植物的生長點細胞分裂速度快，很少感染病毒。因此，采用莖尖培養(yǎng)還可以有效地脫去病毒，從而獲得更加健壯的植株。植物基因工程技術的發(fā)展也借助了植物組織培養(yǎng)技術。培養(yǎng)中的植物組織或細胞為外源基因的導入提供了便利；轉基因植物的實驗室篩選和大量繁殖也離不開植物的組織培養(yǎng)。由于植物的組織培養(yǎng)技術科技含量高，繁殖速度快，在農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)中已獲得廣泛應用。

2）研究的目的與意義

隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，物質文化生活水平的提高，我國城鄉(xiāng)園林綠化得到了飛速發(fā)展，這對美化生活、減少環(huán)境污染、改善生態(tài)環(huán)境起到了很大的促進作用，但是，我們也應該充分認識到目前我國城市綠地建設中已存在不少問題，城市園林植物種類較為單一，城市生物多樣性建設受到影響，特別是地被植物材料嚴重匱乏，導致了草坪面積發(fā)展過大、用水量過多、養(yǎng)護費用居高不下等問題，影響了城鄉(xiāng)建設持續(xù)性發(fā)展。各級政府和組織對植物的種類和品質提出了更高的要求，迫切要求引進能部分代替草坪、抗旱節(jié)水、管理費用低和觀賞性強的優(yōu)質地被植物，以豐富城市園林景觀，豐富生物多樣性，建設更接近自然的生態(tài)型城市。宿根花卉-大花萱草因其觀賞期長、觀賞性高、適用性強、種類豐富、群體功能強等優(yōu)點日益受到人們的重視，因而大花萱草的研究和利用面臨著一個良好的機遇和發(fā)展前景。

大花萱草(Hemerocallis hybrida)，為百合科萱草屬多年生宿根草本植物。萱草屬植物全世界共約有15～18個種（中國科學院中國植物志編輯委員會，1980），主要分布于亞洲溫帶至亞熱帶地區(qū)，歐洲有少量分布，其中原產(chǎn)我國的就約有11種（北京林業(yè)大學園林系花卉教研組，1988），是世界上萱草屬植物種類最多、分布最廣的國家。大花萱草主要用途是觀賞，因其具有既可觀花又可觀葉的雙重價值而廣泛用于切花、盆栽及園林綠化等。萱草花蕾可食用，根可入藥，集觀賞、食用、藥用于一身，是極為可貴的植物資源。

3）植物細胞全能性的表達

早在20世紀初，德國著名植物學家Haberlandt根據(jù)細胞學的理論就曾預言，植物細胞具有全能性（Totipotency）。也就是說每個體細胞像胚胎細胞一樣，可以經(jīng)過體外培養(yǎng)成為一個完整的植株，這是因為植物體的每個細胞都含有該個體的全部遺傳信息，都具有一套完整的基因組，因而具有在適宜條件下可以被誘導分化形成完整植株的潛在能力。直至20世紀50年代末科學家在胡蘿卜組織單細胞懸浮培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)某些細胞在形態(tài)上轉變?yōu)榕c合子胚相似的結構，其發(fā)育過程也與合子胚類似，但由于它是從體細胞分化而來的因而稱之為體細胞胚，并由此形成了再生植株，直到開花結實。這一重大突破不僅證實了植物細胞的全能性，而且為細胞離體培養(yǎng)中研究形態(tài)發(fā)生機制開拓了一個新的領域。近20余年，植物組織和細胞培養(yǎng)技術得到了迅速發(fā)展，大量植物無論是二倍體細胞或單倍體性細胞以及原生質體離體培養(yǎng)均可獲得再生植株。大量事實證明，植物體成熟組織中已高度分化的細胞液保留了回復到分生組織狀態(tài)的能力[6]。當然，細胞能夠經(jīng)歷這一回復過程的程度是不同的，這主要取決于細胞所達到的發(fā)育上的、生理上的和細胞上的狀態(tài)。

4）形態(tài)發(fā)生

所謂形態(tài)發(fā)生就是生物個體發(fā)育或再生過程中，機體及其器官形態(tài)結構的形成過程。在生物學領域內已經(jīng)成為一門學科，而且深入到組織和細胞的形態(tài)發(fā)生問題。它不用于形態(tài)學、生理學和胚胎學，而是在應用這些學科知識的基礎上，結合生物化學、生理物理學和遺傳學的知識和技術、專門研究形態(tài)發(fā)生中有關分化、對稱、極性和相關性等現(xiàn)象的外界條件因子、內在生理化學及遺傳基礎，從而了解其機制，已達到控制目的的一門學科。植物組織或細胞離體培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生有器官發(fā)生和體細胞胚胎發(fā)生這倆種途徑形成再生植株。這兩種形態(tài)發(fā)生途徑都是以細胞分化為基礎的，它包含了組織和器官的形成。已分化的細胞各自組成了不同的組織，一般形態(tài)和技能相同的細胞組成同一種組織，然后再由機能相關的組織形成器官。形態(tài)發(fā)生的最后結果是形成以個發(fā)育成熟的發(fā)育植株。

1 材料與方法

1.1 材料:供試大花萱草植株

1.1.1 試劑

乙醇。

吲哚乙酸（IAA）或 2，4-D（生長素類似物）。

氯化汞（升汞）或次氯酸鈉。

6-芐基氨基腺嘌呤（6-BA）

MS培養(yǎng)基

0.1 mol/L NaOH與0.1mol/L HCl

1.1.2 儀器設備

培養(yǎng)室，高壓滅菌鍋，水浴鍋，解剖刀，三角燒瓶（100mL），燒杯，量筒，培養(yǎng)皿，棉線，接種箱或超凈工作臺，分析天平，長鑷子，剪刀，容量瓶，移液管，牛皮紙。

1.2 分株繁殖

分株苗床，寬1-2m，長2-3m，每隔20cm，挖一深約6cm穴。將分蘗苗移植其中，之后覆土，分株苗處理。在萌芽前，將株叢從盆中挖出，去掉傷根、病根，盡量保留肉質根。栽植應選擇晴天進行，邊挖邊分栽，盡量少傷根，一般2-3年分株一次，以保證植株旺盛生長。本實驗以10盆為一組，先設計重復。

1.3 組織培養(yǎng)擴大繁殖

植物組織培養(yǎng)的簡單過程如下:剪接植物器官或組織——經(jīng)過脫分化（也叫去分化）形成愈傷組織——再經(jīng)過再分化形成組織或器官——經(jīng)過培養(yǎng)發(fā)育成一顆完整的植株。

植物組織培養(yǎng)的大致過程是:在無菌條件下，將植物器官或組織（如芽、莖尖、根尖或花藥）的一部分切下來，放在適當?shù)娜斯づ囵B(yǎng)基上進行培養(yǎng)，這些器官或組織就會進行細胞分裂，形成新的組織。不過這種組織沒有發(fā)生分化，只是一團薄壁細胞，叫做愈傷組織。再適合的光照、溫度和一定的營養(yǎng)物質與激素等條件下，愈傷組織便開始分化，產(chǎn)生出植物的各種器官和組織，進而發(fā)育成一棵完整的植株。

植物組織培養(yǎng)即植物無菌培養(yǎng)技術，是根據(jù)植物細胞具有全能性的理論，利用植物體離體的器官如根、莖、葉、莖尖、花、果實等）組織（如形成層、表皮、皮層、髓部細胞、胚乳等）或細胞（如大孢子、小孢子、體細胞等）以及原生質體,在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及光照、溫度等人工條件下，能誘導出愈傷組織、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的學科。

1.3.1 配制培養(yǎng)基

配制MS培養(yǎng)基母液和NAA、6-BA等激素母液，比例為大量元素100mL/L，微量元素 10mL/L，有機物 10mL/L，無機鹽 10mL/L，NAA0.01mL/L，6-BA4mg/L，瓊脂 7.5mg/L，蔗糖 30mg/L，調 pH 值 5.6～5.8，放在三角瓶中，每瓶大致40mL，高壓滅菌鍋中滅菌，備用。

表1 配置MS培養(yǎng)基所需試驗材料及配置方法

培養(yǎng)基分類:

（1）愈傷組織誘導培養(yǎng)基:MS培養(yǎng)基（蔗糖含量為 10g/L，2，4-D含量為 2mg/L，瓊脂10g/L）。

（2）試驗培養(yǎng)基:在 MS培養(yǎng)基中加入 IAA和 6-BA。

吲哚乙酸（IAA)先用少量0.1 mol/L NaOH溶解，6-芐基氨基腺嘌呤先用少量0.1 mol/L HCl溶解，然后用蒸餾水稀釋，再加入培養(yǎng)基中。

1.3.2 取材與消毒

取實驗材料，用流水沖洗4-5次，用刀將莖外部切掉，并將莖切成小段，取每一段上帶有1-2個芽點植株為外植體，再用蒸餾水沖洗，然后放到超凈工作臺上表面滅菌，流程為70%酒精20s-50mLNaF10min——無菌水沖洗3-5次，然后接種。

1.3.3 接種培養(yǎng)

將消毒過的萱草外植體在消過毒的濾紙上切成0.5cm大小方塊，接種到培養(yǎng)基上，每瓶接種三個，接種過程中，所用器具應用75%酒精棉擦拭，酒精燈火焰上消毒。避免工具帶菌，造成交叉感染，接種后將培養(yǎng)瓶移入培養(yǎng)箱上培養(yǎng)，溫度控制在22度左右，每天光照12-16h，光照強度1000-2000lx，一般培養(yǎng)1-7d后，莖段邊緣突起分化成芽。待10d后，繼代培養(yǎng)。

1.3.4 初代培養(yǎng)

初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某些外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時，常用誘導或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括:莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。

采用外源的細胞分裂素，可促進使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側芽啟動生長，從而形成一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結構。在幾個月內可以將這種叢生苗的一個枝條轉接繼代，重復芽苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整小植株。

在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性（這與胚狀體不同）。多數(shù)情況下它形成芽，后形成根。

1.3.5 繼代培養(yǎng)

在超凈工作臺上，將初代培養(yǎng)的芽叢分割，同時用解剖刀將植株底部褐化部分、新葉切除，以減少由于葉片生長而引起營養(yǎng)物質消耗，對芽分化的抑制從而促進芽的分化，達到實驗目的同時統(tǒng)計每瓶中外植體分化芽的數(shù)目。實驗以10瓶為一組，共計10個重復。

2 結果與分析

2.1 分株發(fā)芽率和組織培養(yǎng)繁殖率

2.1.1 每一母株分化芽數(shù)量統(tǒng)計表

表2

2.1.2 組織培養(yǎng)數(shù)量統(tǒng)計表

表3

2.1.3 分株發(fā)芽率和組織培養(yǎng)繁殖率比較

分株繁殖一輪發(fā)芽率75.3%，繁殖率較高，組培三周左右繁殖率達5.33%。比較得知，組培較分株繁殖率高，而且時間短，可達到短期繁殖目的。

2.2 各因素對大花萱草擴繁的影響

在本實驗中，曾出現(xiàn)污染現(xiàn)象，原因可能是:

2.2.1 實驗儀器消毒未凈

2.2.2 解剖刀鈍，殺死組織或引起葉片卷曲

2.2.3 葉片生長接觸三角瓶蓋，引起植株感染

2.2.4 對外植體消毒時，未將組織病毒全部殺死

2.2.5 每次操作后對儀器滅菌不干凈引起交叉感染

圖1 組織培養(yǎng)Figure 1 Tissue culture

3 討論

通過分析，規(guī)范操作技術，最終達到無污染，快速繁殖的結果，形成一整套快繁技術。

在結果中，認為分株和組培均可達到繁殖要求，但組培要求過高，實驗儀器精密，需要專業(yè)人員操作，而且耗費太大。對于一些稀有品種或結實率不高的品種，可以采用組培達到目的，以保存物種；對于普通品種，分株即可達到擴繁目的。

通過實驗，了解并掌握了如何快速準確的查找資料，提高了分析問題，解決問題的能力。經(jīng)過對最初實驗失敗原因總結，對實驗條件，實驗過程有了全面的認識，為以后實驗的順利進行打下良好的基礎。但由于掌握的知識有限，雖在實驗的過程中不斷發(fā)掘明確實驗目的和方法，但試驗仍有一些不足之處，希望在今后的實驗中完善。

本實驗中大花萱草培養(yǎng)的器官分化途徑有三種情況:一是，在愈傷組織表面形成芽；二是，在愈傷組織內部形成根；三是，在同一塊愈傷組織的內外分別形成根和芽。一般來說，先形成芽的經(jīng)再培養(yǎng)較易形成根，種植容易成活；而先產(chǎn)生根的在培養(yǎng)45d后仍未見形成芽，至于繼續(xù)培養(yǎng)下去能否在其上方分化出芽，還需要做進一步深索。

4 結語

通過組培可使大花萱草得到擴繁，快繁無病毒不變異苗木。在實驗過程中一定要注意充分消毒，防止感染。組培中容易發(fā)生褐化、玻璃化現(xiàn)象。在操作時盡量采用不易變異的外植體擴繁，以縮短繼代時間。限制繼代次數(shù)。每隔一定繼代次數(shù)后重新開始。切取外植體材料時，采取適當?shù)纳L調節(jié)物質種類和較低濃度，或少或不使用培養(yǎng)基中易引起變異的化學物質。定期配制，及時處理，跟蹤檢測，最終形成一套擴繁方法，指導大花萱草在北方地區(qū)引種生產(chǎn)及應用，從而使其在園林中更有用。

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