孫華　王春燕　宋楊　吳樹敬　張芮　馮守千　陳曉流　陳學(xué)森

摘 要： 【目的】研究克隆新疆紅肉蘋果 [Malus sieversii f. neidzwetzkyana（Dieck） Langenf] PGIP基因并進(jìn)行原核表達(dá)，探討其抗病機(jī)制。【方法】根據(jù)Genbank 中已經(jīng)發(fā)表的‘金冠蘋果PGIP保守區(qū)域設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物，以新疆紅肉蘋果葉片總RNA為模板，T/A克隆后進(jìn)行序列測(cè)定，并對(duì)該序列進(jìn)行分析。隨后將該蛋白成熟肽cDNA片段連接到原核表達(dá)載體pET30a（+）中，構(gòu)建融合表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到E. coli BL21（DE3）中進(jìn)行表達(dá)?！窘Y(jié)果】序列分析表明，新疆紅肉蘋果PGIP基因cDNA編碼區(qū)全長993 bp，編碼330 個(gè)氨基酸殘基，命名為MsPgip，GenBank登錄號(hào)為JQ001783。MsPgip分子質(zhì)量為36.6 kD，等電點(diǎn)為7.05，有6個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，信號(hào)肽為N端24個(gè)氨基酸殘基。該蛋白質(zhì)還具有2個(gè)連續(xù)的24個(gè)氨基酸殘基大小的LRR基序（LSQLKNLTFLDLSFNNLTGAIPSSLSQ LPNLNALHLDRNKLTGHIPIS）。與已克隆的‘澳洲青蘋、‘金冠、‘富士蘋果PGIP氨基酸序列同源性均高達(dá)99%。原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析表明，表達(dá)蛋白的分子質(zhì)量與預(yù)期一致。【結(jié)論】克隆了新疆紅肉蘋果PGIP基因，并可在大腸桿菌中表達(dá)。

關(guān)鍵詞： 新疆紅肉蘋果； 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白； 基因克?。?表達(dá)

中圖分類號(hào)：S661.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1009-9980？穴2013？雪01-0001-07

探討病害形成及抗病機(jī)理、培育抗病品種是果樹病害科學(xué)防控最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一。我國北方落葉果樹常見的真菌性病害主要有輪紋病、腐爛病、炭疽病、白粉病、黑星病等，這些病害不僅危害果樹的根、莖、葉，也危害果實(shí)[1]。真菌入侵植物時(shí)，必須首先穿越植物細(xì)胞壁，以啟動(dòng)和擴(kuò)大感染，真菌可分泌一系列的酶來降解植物細(xì)胞壁，而內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶（Endo-polygalacturonases，Endo-PGs）是真菌首先分泌的細(xì)胞壁降解酶。植物產(chǎn)生的多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting proteins，PGIPs）能夠與病原菌的PGs專一、可逆的結(jié)合，形成一種高親和復(fù)合物，從而抑制病原菌PGs的活性，并使具有生物活性的寡聚半乳糖醛酸苷（oligogalacturonides，OGs）的穩(wěn)定期相對(duì)延長，從而引發(fā)多種防衛(wèi)反應(yīng)，增強(qiáng)植物抗性[2]。

新疆野蘋果（或塞威士蘋果，Malus sieversii Roeml）為伊犁野果林的建群種，是第三紀(jì)孑遺物種，同時(shí)也是現(xiàn)代栽培蘋果（Malus domestica Borkhl）的祖先種，十分珍貴[3]。盡管國家已在伊犁地區(qū)建立了新疆野蘋果自然保護(hù)區(qū)，但由于農(nóng)田開發(fā)及過度放牧等原因，導(dǎo)致新疆野蘋果資源正遭到嚴(yán)重破壞，群落面積急劇減少，保護(hù)這一寶貴種質(zhì)資源迫在眉睫。為此，本課題組在對(duì)新疆野蘋果形態(tài)、化學(xué)成分（糖、酸及香味與酚類物質(zhì)組分以及礦質(zhì)元素含量等）、分子系統(tǒng)學(xué)等多個(gè)層面進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)的基礎(chǔ)上，研究建立了核心種質(zhì)構(gòu)建及離體超低溫保存技術(shù)體系，構(gòu)建了新疆紅肉蘋果與‘紅富士等栽培蘋果品種雜種F1分離群體，已定植雜種實(shí)生苗4萬余株，研究發(fā)現(xiàn)，新疆野蘋果在表型與分子層面均存在豐富的遺傳多樣性，是進(jìn)行蘋果功能成分育種的重要基因庫，并已從F1群體中選育出一批功能成分含量高的紅肉蘋果新品系[4-6]；胡小平等[7-8]對(duì)蘋果種質(zhì)資源抗黑星病特性進(jìn)行的鑒定結(jié)果表明，15個(gè)參試蘋果種質(zhì)可被劃分高度抗病、中度抗病、中度感病及高度感病4種類型，其中新疆野蘋果和‘秦冠為高度抗病品種，其抗病性表現(xiàn)在抗侵入和抗擴(kuò)展兩個(gè)方面，但有關(guān)新疆野蘋果抗病的分子機(jī)理至今未見研究報(bào)道。為此，我們以新疆紅肉蘋果為材料，進(jìn)行PGIP基因的克隆及原核表達(dá)，旨在為進(jìn)一步的蘋果抗病分子機(jī)理研究提供基本資料，并為新疆野蘋果資源的有效保護(hù)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試材

試驗(yàn)于2010—2011年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和山東農(nóng)業(yè)大學(xué)泰安橫嶺果樹育種基地進(jìn)行，供試材料為新疆紅肉蘋果（Malus sieversii f. neidzwetzkyana）‘夏紅肉4 a生嫁接苗，取新鮮葉片帶回實(shí)驗(yàn)室，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

以新疆紅肉蘋果新鮮幼葉為材料，采用大連寶生物公司的Trizol試劑提取該組織總RNA，進(jìn)行RNA質(zhì)量和濃度檢測(cè)后取1 μg的總RNA用于cDNA第1鏈的合成。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中公布的‘金冠蘋果PGIP基因的保守序列和原核表達(dá)載體pET30a（+）多克隆酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)特異引物。MsPgip-F： 5′-CTGGATCC ATGGAACTCAACT-CAAGTTCTCC-3′，MsPgip-R： 5′-TTGTCGACTTACTTGCAGCTTGGGAG-3′。在上下游引物的5′端分別加入BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基（下劃線部分為酶切位點(diǎn)，斜體部分為保護(hù)堿基）。

1.4 PGIP基因的克隆

參照大連寶生物公司的RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0試劑盒說明書合成cDNA第1鏈。

以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件： 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性45 s，48 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。參照索來寶多功能凝膠回收試劑盒說明書回收PCR產(chǎn)物。回收產(chǎn)物與pMD18-T-simple載體連接，轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，PCR確認(rèn)后送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。重組質(zhì)粒命名為pMD-MsPgip。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI網(wǎng)站上的BLASTn程序進(jìn)行同源序列比對(duì)；DNAMAN軟件分析ORF，推導(dǎo)氨基酸序列，預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、親水性與疏水性，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；SignalP 3.0Server預(yù)測(cè)信號(hào)肽。

1.6 MsPgip基因在大腸桿菌中的表達(dá)

根據(jù)克隆的MsPgip序列以及原核表達(dá)載體pET30a（+）多克隆酶切位點(diǎn)序列，用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pMD-MsPgip和原核表達(dá)載體pET30a（+），分別回收插入的目的片段和表達(dá)載體，將2者按照摩爾比1∶3混合后，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取陽性克隆測(cè)序。同時(shí)，依照北京索來寶科技有限公司的DNA質(zhì)粒小提試劑盒說明書進(jìn)行提取質(zhì)粒DNA，然后進(jìn)行酶切鑒定。融合表達(dá)重組質(zhì)粒命名為pET-MsPgip。

重組質(zhì)粒pET-MsPgip轉(zhuǎn)化E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取抗性單菌落接種于2 mL液體LB培養(yǎng)基（含100 mg·L-1卡那霉素）37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日以1∶100的比例轉(zhuǎn)接到新的液體LB培養(yǎng)基中（含100 mg·L-1卡那霉素）37 ℃振蕩培養(yǎng)2 h（OD600大約為0.5），隨后加入異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)劑（終濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1 mmol·L-1）進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。同時(shí)以pET-30a（+）質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌加IPTG（終濃度1 mmol·L-1）誘導(dǎo)為正對(duì)照，以未加IPTG誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒為負(fù)對(duì)照。誘導(dǎo)2 h后收集菌體。菌體中加入菌液體積10%的1×SDS-PAGE 上樣緩沖液（50 mmol·L-1 Tris-HCl（pH 6.8），2% SDS， 0.1%溴酚藍(lán)，10%甘油，1% DDT），100 ℃煮沸5 min，立即冰浴2 min，最大轉(zhuǎn)速離心5 min，取20 μL樣品（即為總蛋白）上樣，進(jìn)行SDS-PAGE（5%濃縮膠和10%分離膠）電泳分析。凝膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色并脫色至背景清晰。

2 結(jié)果與分析

2.1 MsPgip的克隆和序列分析

以紅肉蘋果葉片cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR，獲得了預(yù)期大小的單一條帶。將該片段連接到pMD18-T-simple載體后測(cè)序，結(jié)果表明，該基因的讀碼框（ORF）為993 bp。命名為MsPgip，GenBank登錄號(hào)為JQ001783。MsPgip基因編碼330個(gè)氨基酸（圖1）。其中，酸性氨基酸32個(gè)，占9.7%，堿性氨基酸32個(gè)，占9.7%。分子質(zhì)量約為36.6 kD，等電點(diǎn)為7.05。將該基因編碼的氨基酸序列分別采用隱馬爾科夫模型和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)方式進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)， 結(jié)果均表明該蛋白質(zhì)信號(hào)肽為N端的24個(gè)氨基酸殘基，蛋白質(zhì)裂解點(diǎn)位于第24位絲氨酸（ Ser） 與第25位天冬氨酸（ Asp） 殘基之間。蛋白質(zhì)親水性和疏水性分析表明，該蛋白質(zhì)N 端24 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成一明顯的疏水區(qū)域，這與信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合。此外，其N端含有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，N端和C端分別含有5個(gè)、4個(gè)參與二硫鍵形成的半胱氨酸殘基。序列保守性分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)還具有2個(gè)連續(xù)的24個(gè)氨基酸長的LRR基序 （LSQLKNLTFLDLS FNNLTGAIPSSLSQLPNLNALHLDRNKLTGHIPIS）。這是多數(shù)植物抗病基因PGIP表達(dá)蛋白特有的保守序列。

2.2 MsPgip同其他PGIPs的比較

將MsPgip與GenBank中登陸的其他PGIPs基因氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果顯示，MsPgip同薔薇科類PGIPs具有很高的同源性，如： 與桃84%、美洲李85%、湖北海棠97%、西洋梨98%。從進(jìn)化關(guān)系來看，新疆紅肉蘋果同‘澳洲青蘋、‘金冠、‘富士、湖北海棠、西洋梨聚在一起，同玉米、大豆、擬南芥關(guān)系甚遠(yuǎn)。

MsPgip與‘澳洲青蘋、‘富士、‘金冠PGIP的氨基酸序列同源性均高達(dá)99%，只有3個(gè)氨基酸不同（圖3）?！闹耷嗵O、‘富士、‘金冠氨基酸序列第7、185、218位點(diǎn)分別是I（異亮氨酸）、K（賴氨酸）、T（蘇氨酸），而新疆紅肉蘋果氨基酸序列第7、185、218位點(diǎn)分別是T（蘇氨酸）、I（異亮氨酸）、G（甘氨酸）。

2.3 MsPgip在大腸桿菌中的表達(dá)

2.3.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及重組子的鑒定 提取pMD-MsPgip和pET30a（+）質(zhì)粒，同時(shí)用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切，回收插入片段和表達(dá)載體，將2者按照摩爾比1∶3混合后，用T4 連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-MsPgip。用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pET-MsPgip，可切出1 000 bp左右片段。為了進(jìn)一步證明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，在酶切鑒定的基礎(chǔ)上，對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒pET-MsPgip進(jìn)行了序列測(cè)定。序列測(cè)定結(jié)果表明，連入表達(dá)載體pET30a（+）中的基因片段與目的序列一致，并且酶切位點(diǎn)連接處序列也正確，未出現(xiàn)堿基突變及移碼現(xiàn)象。表明已獲得了正確的MsPgip的原核表達(dá)重組質(zhì)粒。

2.3.2 SDS-PAGE分析 重組質(zhì)粒pET-MsPgip在大腸桿菌BL21（DE3）中通過IPTG誘導(dǎo)融合表達(dá)。結(jié)果表明，在37.6 kD（含標(biāo)簽大?。┳笥椅恢糜心康牡鞍椎娜诤媳磉_(dá)條帶（圖4），表達(dá)的融合蛋白分子量大小與理論預(yù)測(cè)值相符，而正負(fù)對(duì)照在37.6 kD左右均未有表達(dá)，這說明融合蛋白在E. coli BL21（DE3）中成功表達(dá)。

經(jīng)過不同濃度IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，目的融合蛋白在不同濃度下表達(dá)量變化沒有顯著差異。表明 IPTG 濃度對(duì)融合表達(dá)載體pET-MsPgip表達(dá)水平影響不大。

3 討 論

提質(zhì)增效是我國蘋果產(chǎn)業(yè)的主旋律，圍繞這一主題，一方面要進(jìn)一步加強(qiáng)品質(zhì)育種，同時(shí)要瞄準(zhǔn)國際蘋果產(chǎn)業(yè)發(fā)展前沿，研究建立適應(yīng)中國國情的現(xiàn)代蘋果栽培模式，即良種與良法配套[4]。選育并推廣抗病蘋果品種，可有效減少農(nóng)藥的使用量，是提質(zhì)增效的重要途徑之一；已有的研究結(jié)果表明，新疆野蘋果不僅富含多酚等功能成分，是進(jìn)行蘋果功能成分育種的重要基因庫，而且高抗蘋果黑星病[5，7]。為此，進(jìn)一步開展新疆野蘋果抗病分子機(jī)理研究，創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)抗病蘋果新品種，對(duì)于新疆野蘋果這一珍貴資源的科學(xué)保護(hù)與有效利用以及我國蘋果產(chǎn)業(yè)的優(yōu)質(zhì)高效發(fā)展具有重要意義。

植物PGIP與病原真菌PGs相互作用是從分子水平上研究植物L(fēng)RR介導(dǎo)特異識(shí)別的一種模式系統(tǒng)，而LRR是大多數(shù)植物抗病基因PGIP表達(dá)蛋白特有的重復(fù)序列[9]。PGIP通過LRR基序上暴露于外表面的氨基酸殘基來發(fā)揮其抑制PGs活性的作用[10]，這些暴露于外表面的氨基酸殘基發(fā)生突變則會(huì)嚴(yán)重影響其活性[11]；在果樹方面，目前已從梅、桃以及‘澳洲青蘋、‘金冠與‘富士蘋果品種中克隆得到了PGIP基因[12-14]，其中從3個(gè)蘋果品種中克隆得到的PGIP基因cDNA編碼區(qū)全長均為993 bp，編碼330個(gè)氨基酸殘基，都含有2個(gè)連續(xù)的24個(gè)氨基酸殘基大小的LRR基序。本研究以新疆紅肉蘋果為材料，從新鮮幼葉中克隆得到其PGIP基因。序列分析表明，新疆紅肉蘋果PGIP基因cDNA編碼區(qū)全長993 bp，編碼330個(gè)氨基酸殘基。蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為36.6 kD，等電點(diǎn)為7.05，有6個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)，信號(hào)肽為N端24個(gè)氨基酸殘基。該蛋白質(zhì)還具有2個(gè)連續(xù)的24個(gè)氨基酸殘基大小的LRR基序。將本實(shí)驗(yàn)克隆得到的新疆紅肉蘋果的PGIP氨基酸序列同‘澳洲青蘋、‘金冠與‘富士蘋果的PGIP氨基酸序列比較發(fā)現(xiàn)，4者在139～186位點(diǎn)都含有2個(gè)連續(xù)的24個(gè)氨基酸長的LRR基序，所不同的是第185位點(diǎn)氨基酸殘基發(fā)生了突變，新疆紅肉蘋果為異亮氨酸（I），其他3個(gè)品種為賴氨酸（K）。新疆野蘋果是現(xiàn)代栽培蘋果的祖先種，在長期的進(jìn)化過程中，3個(gè)栽培品種PGIP氨基酸序列在同一位置的突變導(dǎo)致PGIP活性發(fā)生了變化，抑制PGs能力下降，從而對(duì)黑星病的抗性降低。因此推測(cè)PGIP第185位氨基酸突變是導(dǎo)致‘澳洲青蘋、‘金冠與‘富士蘋果抗黑星病的能力下降以及新疆野蘋果對(duì)黑星病具有最高抗性的可能原因，有待進(jìn)一步研究。

有研究表明，不同來源的PGIP其抑菌效果存在差異[15]，因此，在通過轉(zhuǎn)PGIP基因進(jìn)行植物抗病育種前有必要進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，大腸桿菌是最常用的外源基因表達(dá)宿主。本研究中MsPgip在大腸桿菌中成功表達(dá)，但其可溶性及抑菌效果如何有待驗(yàn)證。因此有必要將得到的原核表達(dá)蛋白進(jìn)行分離純化，進(jìn)一步驗(yàn)證其抑菌效果并進(jìn)行真核生物表達(dá)研究，以便為蘋果抗病育種奠定基礎(chǔ)。

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