摘要：疾病標記物分子印跡聚合物以疾病標記物為模板分子，可實現(xiàn)低濃度和基底復雜的疾病標記物的高效分離和富集。以疾病標記物分子印跡聚合物為敏感元件構(gòu)建的傳感器，可用于對威脅人類健康的高發(fā)病率和高死亡率疾病進行篩查和診斷。本文介紹了分子印跡技術(shù)的原理和方法，重點介紹了疾病標記物分子印跡中常用的印跡方法、印跡材料、以及疾病標記物分子印跡聚合物在疾病標記物分離及傳感中的應用。

關(guān)鍵詞：分子印跡； 疾病標記物； 分離； 傳感； 評述

1引言

疾病標記物是指當身體出現(xiàn)疾病時在血漿或其它體液中能夠檢測到的物質(zhì)，是指示疾病存在的生物化學指標。然而，很多疾病的早期癥狀不明顯，當采用常規(guī)方法確診疾病時，往往已發(fā)展到晚期，不利于疾病的早期診斷和患者的長期生存。因此，疾病標記物的篩查及其早期檢測，對疾病診斷、藥物選擇、判斷分期、實現(xiàn)個體化治療以及預后具有重要意義。目前，疾病標記物的檢測以免疫分析法為主，包括酶聯(lián)免疫分析法、電化學發(fā)光免疫法、放射免疫分析法等[1]。然而，以上方法往往存在操作繁瑣、影響因素多、甚至放射性污染等問題，使得其在疾病標記物早期檢測和普及應用等方面受到一定限制。因此，疾病標記物的特異性和靈敏性檢測新方法成為研究熱點。

分子印跡聚合物（Molecularly imprinting polymers， MIPs）具有制備方法簡單、成本低、易于大規(guī)模制備、能耐受酸堿等復雜環(huán)境等優(yōu)點，可作為模擬抗體和受體[2]、吸附分離材料[3]、仿生化學傳感器的敏感元件[4]、選擇性催化劑[5]等，在分離富集、化學傳感、藥物控釋和催化等領(lǐng)域有良好的應用前景[6]。Vlalakis等[7]以MIPs代替常規(guī)抗體，對藥物中的嗎啡和茶堿進行了放射免疫分析，不僅交叉反應結(jié)果可與生物單抗相媲美，而且抗茶堿分子印跡聚合物對病人血漿中茶堿的定量分析結(jié)果也完全符合醫(yī)學檢測要求，表明印跡聚合物抗體和受體可以作為生物抗體的理想替代品和有益補充。Sellergren等[8]首次將分子印跡技術(shù)用于固相萃取領(lǐng)域，以AIDS抑制藥戊脒為模板分子制備分子印跡聚合物，并將其填充于色譜柱中，用于對尿樣中戊脒的高效分離，解決了傳統(tǒng)固相萃取法難以實現(xiàn)復雜基質(zhì)中戊脒有效分離的難題。Greene等[9]采用分子印跡技術(shù)構(gòu)建了可同時識別7種不同芳香胺化合物的比色法陣列傳感器，首次實現(xiàn)了結(jié)構(gòu)相似且沒有光活性的多組分藥物的同時分離檢測。

近年來，分子印跡聚合物模擬天然受體在膽固醇、多肽、蛋白質(zhì)等疾病標記物識別檢測等方面取得了較好的研究進展，引起了廣泛關(guān)注[10]。以疾病標記物為模板分子，將分子印跡技術(shù)應用于疾病標志物的識別和檢測，將為實現(xiàn)疾病的早期診斷提供新途徑。本文概述了分子印跡技術(shù)的發(fā)展概況、原理和方法，介紹疾病標記物印跡中常用的印跡方法和印跡材料，重點介紹膽固醇、甲胎蛋白、癌胚抗原等疾病標記物分子印跡聚合物在分離、富集和傳感中的應用。2分子印跡基本原理

20世紀40年代，Pauling提出以抗原為模板合成抗體的理論，其中結(jié)合位點應和空間匹配的觀點成為分子印跡的基本思想。1949年Dickey發(fā)現(xiàn)，在合成硅膠時加入甲基橙，可使硅膠對甲基橙的吸附量增加，由此提出了“專一性吸附”的概念，這一研究被視為“分子印跡”的萌芽[11]。1973年，Wulff等[12]首次以D甘油酸和D甘露醇的乙烯基衍生物為模板分子，采用共價印跡法合成了對糖類化合物有良好選擇性的分子印跡聚合物，利用洗脫D甘油酸和D甘露醇分子后形成的印跡空腔，分別實現(xiàn)了甘油酸分子和甘露醇分子的手性拆分。但是，共價型模板聚合物的動力學過程較慢，不適合目標分子的快速識別。1984年，Morrlow等[13]創(chuàng)立了非共價型分子印跡法（分子自組裝法），模板分子和功能單體之間以非共價鍵自發(fā)形成具有多重作用位點的單體模板分子復合物，經(jīng)過交聯(lián)、聚合后將模板分子和功能單體之間的相互作用保存下來，該法可在溫和條件下洗脫模板分子，對客體的識別和釋放速度快。然而，非共價法印跡過程的輪廓不夠清晰，大量功能單體的存在還降低了聚合底物的選擇能力。Whitcombe等[14]發(fā)展了共價與非共價印跡雜化體系法（犧牲空間法），即聚合時采用共價鍵方式將模板分子和聚合單體結(jié)合，對客體分子識別時則采用非共價鍵結(jié)合方式，采用這種方法得到的分子印跡聚合物既有共價印跡聚合物親合專一性強的優(yōu)點，又有非共價印跡操作條件溫和的優(yōu)點，因此，犧牲空間法引起了廣泛的研究。分子印跡技術(shù)以其通用性和立體專一性得到了世界矚目并迅速發(fā)展起來。分子印跡技術(shù)根據(jù)目標模板分子的大小、空間結(jié)構(gòu)和電荷分布，選擇合適的功能單體和交聯(lián)劑，功能單體和模板分子通過分子間作用形成單體模板分子復合物，用交聯(lián)劑交聯(lián)聚合后形成交聯(lián)聚合物，將功能單體在特定的空間取向上固定下來；通過物理或化學手段再將模板分子從交聯(lián)聚合物中洗脫，在聚合介質(zhì)中保留下模板分子的“印跡”或留下“記憶”，形成具有在空間構(gòu)型和結(jié)合位點上與模板分子相匹配的空腔；由此形成的MIPs具有特異性的識別功能基團和與模板分子空間結(jié)構(gòu)互補的多重作用位點，對模板分子有較高的親和力和特異性結(jié)合能力，可實現(xiàn)對混合物中目標分子的有效分離和特異性識別。

3疾病標記物印跡聚合物制備

3.1印跡材料

疾病標記物是生物分子，當遠離生物環(huán)境時容易變性失活。因此，在合成疾病標記物分子印跡聚合物的過程中，選擇合適的功能單體、交聯(lián)劑和溶劑，對提高分子印跡聚合物對模板分子的親合力、選擇性、增強識別位點的有效性和數(shù)量等十分重要。根據(jù)印跡材料化學性質(zhì)的不同，可將常用的合成疾病標記物分子印跡聚合物的材料分為有機材料和無機材料。

3.1.1有機材料含有不飽和雙鍵的有機化合物（甲基丙烯酸、4乙烯基苯硼酸、丙烯酰胺等）是制備分子印跡聚合物最常用的功能單體。這類功能單體利用正負電荷之間的靜電作用、氫鍵作用、疏水作用或金屬螯合作用與目標分子進行結(jié)合，在交聯(lián)劑存在下，通過加熱、光照或氧化等方式引發(fā)聚合，形成有機聚合物，由此制備的分子印跡聚合物具有良好的熱穩(wěn)定性和耐酸堿能力。有機類功能單體種類繁多，研究者可根據(jù)模板分子物化性能的不同選擇合適的功能單體，從而提高印跡聚合物的穩(wěn)定性，改善印跡腔體的識別性能。張圣祖等[15]以N十八烷基馬來酰胺酸為凝膠劑，在甲基丙烯酸怍且陰ァ⒓諄┧?、聚胰~級諄┧狨ズ湍0宸腫 3膽固醇酰氧基丙酸混合物中進行自組裝，形成穩(wěn)定的超分子有機凝膠，經(jīng)紫外光原位聚合形成有機聚合物，再以乙腈為洗脫劑提取模板分子3膽固醇酰氧基丙酸，制備了用于識別膽固醇的非共價印跡聚合物。Miyata等[16]將凝集素刀豆蛋白A（ConA）和多克隆抗甲胎蛋白（AFP）抗體分子分別與N丙烯酰氧琥珀酰亞胺作用，制備成乙烯基修飾的凝集素ConA和乙烯基修飾的多克隆抗甲胎蛋白抗體分子，再將乙烯基修飾的凝集素ConA與丙烯酰胺反應制備丙烯酰胺嫁接的ConA，并以丙烯酰胺嫁接的ConA和乙烯基修飾的多克隆抗甲胎蛋白抗體分子為共同配體，N，N′甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑，制備了動態(tài)識別腫瘤特異性標志物AFP的糖蛋白凝膠，洗脫模板分子后形成含有AFP印跡空腔的蛋白凝膠。當再結(jié)合AFP分子時，凝膠體積收縮，根據(jù)凝膠體積的改變實現(xiàn)AFP分子的特異性識別和檢測，MIPs對AFP識別具有良好的特異性，而且無需復雜的前處理過程，對肝癌的臨床診斷具有重要意義。

3.1.2無機材料分子印跡無機材料主要以四烷氧基硅烷或有機物官能團修飾硅氧烷和四烷氧基硅烷為共同前驅(qū)體，在液相條件下與模板分子均勻混合，經(jīng)水解和縮合形成穩(wěn)定透明的溶膠體系，陳化后形成三維網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的凝膠，經(jīng)干燥和固化后形成干凝膠。該方法制備的凝膠具有大的表面積、均勻的孔徑、良好的熱穩(wěn)定性和光通透性，而且，通過改變前驅(qū)體和操作條件還可簡單地實現(xiàn)其物理化學性質(zhì)的調(diào)節(jié)。Gupta等[17]以硅酸鹽衍生物溶膠凝膠為基質(zhì)，采用水解和非水解兩種方式制備了膽固醇分子印跡聚合物，由氮氣吸附解析曲線計算的MIPs總孔徑體積值表明，以上兩種方式合成的溶膠凝膠基質(zhì)均具有多孔性，同時，MIPs的BrunauerEmmettTeller（BET）特異性表面積值還表明MIPs具有較大的比表面積。對兩種方法合成的MIPs重結(jié)合膽固醇分子的能力及孔徑、比表面積等的比較結(jié)果表明，采用水解法合成的膽固醇分子凝膠具有更好的水溶性和熱穩(wěn)定性，表面吸附及重結(jié)合百分比均比非水解方法合成的印跡聚合物高。然而，有機硅氧烷的官能團比較單一，制備的印跡聚合物對模板分子的特異性識別能力較差。Soares等[18]先將膽固醇分子和饣泛旌希偌尤胨囊已躉柰櫓票傅ü檀 饣泛枘河3.2分子印跡方法

傳統(tǒng)的MIPs制備方法是將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑按一定配比溶解在溶劑（致孔劑）中，在適當條件下引發(fā)聚合，得到高度交聯(lián)的塊狀剛性聚合物，然后經(jīng)粉碎和篩選，得到尺寸合適的顆粒，洗脫模板分子后形成含有特異性識別模板分子空腔的粒子。Yavuz等[19]以N甲基丙烯酰L酪氨酸甲基酯為功能單體，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，膽固醇為模板分子，合成了膽固醇印跡聚合物，用氯仿洗脫模板分子后，利用含有印跡空腔的印跡粒子實現(xiàn)了樣品中膽固醇分子的特異性檢測。雖然這種塊體印跡法所需裝置簡單，普適性強，但塊體印跡法存在研磨過程可控性差、模板分子洗脫困難、印跡位點不均一等問題，使得印跡粒子對目標分子的重結(jié)合效率低。為了解決以上問題，表面分子印跡法應運而生。表面分子印跡法是在或接近載體的表面上生成與模板分子相互作用的結(jié)合位點，有利于模板分子的快速洗脫和高效重結(jié)合，不僅解決了傳統(tǒng)方法對模板分子包埋過深或過緊而導致的無法洗脫等問題，還大大提高了印跡分子與MIPs的結(jié)合速度。Wang等[20]將直腸癌特異性標記物癌胚抗原（CEA）與烷基硫醇混合，通過金巰鍵作用在金覆蓋的硅片表面形成自組裝單分子層，洗脫模板分子后形成的CEA印跡位點能夠特異性結(jié)合CEA分子。將上述制備的傳感元件與電位計連接，通過CEA印跡位點重結(jié)合CEA分子時電位的改變實現(xiàn)對直腸癌細胞培養(yǎng)液中CEA的檢測，獲得了與酶聯(lián)免疫法相一致的結(jié)果。由于CEA分子印跡于烷基硫醇自組裝單分子層表面，大大減小了洗脫模板分子的時間及難度，重結(jié)合CEA分子時，電位達到穩(wěn)定讀數(shù)的時間僅需2～10 min，分析時間明顯縮短。但是該方法的制備過程遠不如傳統(tǒng)的本體聚合簡單、方便、直接。利用納米印跡法合成的聚合物使識別位點充分暴露在納米材料巨大的比表面積上，可大大減少納米印跡聚合物重結(jié)合模板分子過程中的傳質(zhì)阻力，增強吸附過程的動力學特征[21]。Ciardelli等[22]采用反相法將乳液法制備的膽固醇分子印跡納米粒子沉積在甲基丙烯酸甲酯和丙烯酸共聚膜基質(zhì)中，將具有特異性識別膽固醇分子的結(jié)合位點引入到共聚膜基質(zhì)巨大的表面上，加快了膽固醇分子與其結(jié)合位點重結(jié)合的速率，不僅實現(xiàn)了體外血液中膽固醇分子的快速提取，還有效克服了體液中復雜基底對膽固醇識別的影響，為血液中膽固醇識別分析設備的構(gòu)建以及相關(guān)心血管疾病的早期診斷提供了重要依據(jù)。Hoshino等[23]以蜂毒肽為模板分子，以丙烯類有機體分子為功能單體和交聯(lián)劑，采用沉淀聚合法制備了蜂毒肽印跡納米粒子，洗脫模板分子后形成蜂毒肽分子印跡空腔，利用生物素和親和素作用，將生物素化的蜂毒肽分子連接到親和素修飾的石英晶體微天平（QCM）電極表面，印跡納米粒子表面的蜂毒肽分子印跡空腔與蜂毒肽分子特異性結(jié)合而被固定于QCM電極表面，引起QCM電極表面質(zhì)量和頻率的改變，通過對頻率變化的測量實現(xiàn)對蜂毒肽分子的定量檢測。由此合成的印跡納米粒子體積較小，其在溶液中的傳質(zhì)阻力小，有利于對蜂毒肽分子的快速檢測。近年發(fā)展起來的抗原表位印跡技術(shù)，以多肽或蛋白質(zhì)序列中裸露的一個特異性短肽（抗原決定部位）為模板分子，采用合適的功能單體和交聯(lián)劑合成聚合物，洗脫模板分子后留下的印跡腔可對整個多肽和蛋白質(zhì)分子進行有效識別?？乖砦挥≯E聚合物中目標分子的嵌入具有特定的方向，避免了分子印跡過程中蛋白質(zhì)大分子的嵌入，減少了MIPs與目標蛋白的非特異性吸附，而且，以小分子肽為模板分子，還能很好地解決以生物大分子為模板時印跡效率低和洗脫困難等問題。Rachkov等[24]以[Sar1， Ala8]血管緊張素II短肽為模板分子，采用抗原表位印跡技術(shù)在水相中合成分子印跡聚合物，該印跡聚合物不僅能選擇性結(jié)合模板分子短肽，還能結(jié)合整個血管緊張素II分子，對血管緊張素II具有良好的識別特異性。Emgenbroich等[25]采用抗原表位印跡技術(shù)以9芴甲氧羰基磷酸酪氨酸甲酯（FmocpTyrOMe）為模板分子，以尿素、甲基丙烯酰胺和乙二醇二甲基丙烯酸酯為共同功能單體，四氫呋喃為致孔劑，偶氮二異庚腈為引發(fā)劑，制備了FmocpTyrOMe分子印跡聚合物，該印跡聚合物不僅能有效識別pTyr，還能識別含有pTyr的肽段及相關(guān)蛋白質(zhì)。Papaioannou等[26]以甲基丙烯酸為功能單體，以乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，采用抗原表位法合成縮膽囊素的碳端五肽印跡聚合物，洗脫模板分子形成的印跡空腔不僅能識別碳端五肽，還能識別整個縮膽囊素。該方法以小分子碳端五肽替代大分子縮膽囊素為模板分子，用于對整個縮膽囊素的識別，不僅解決了印跡和洗脫縮膽囊素過程困難的難題，還大大提高了對縮膽囊素的重結(jié)合能力。

4疾病標記物分子印跡在分離富集中的應用

4.1固相萃取

固相萃取是將液固萃取與柱液相色譜技術(shù)結(jié)合而來，主要用于樣品的分離、純化和濃縮。傳統(tǒng)固相萃取使用較多的C18鍵合硅膠和石墨化碳黑等吸附劑均為非選擇性萃取吸附劑，作用機理大多基于疏水作用，部分為離子交換，難以滿足復雜樣品的分離分析要求。分子印跡聚合物利用其構(gòu)效預定性和選擇性，針對單一或復雜目標分析物形成具有識別作用和結(jié)構(gòu)互補的空腔，能選擇性結(jié)合混合物體系中的一種或一類結(jié)構(gòu)相似的化合物，從而實現(xiàn)目標分析物的選擇性分離和富集。近年來，分子印跡技術(shù)與固相萃取技術(shù)相結(jié)合，以分子印跡聚合物為選擇性萃取吸附劑在固相萃取中的應用與日俱增[27～29]。呂斌等[30]以甲基丙烯酸為功能單體，乙烯二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，采用非共價熱啟動和紫外聚合法合成了膽固醇MIPs，并以兩種方法合成的MIPs為萃取固定相，實現(xiàn)了血液、蛋黃、牛奶等樣品中膽固醇分子的選擇性分離和檢測。肽鏈A 140和A 142是淀粉樣蛋白的兩種亞型，是阿爾茨海默氏病的重要標記物，Sellergre等[31]分別以A 140和A 142兩條肽鏈碳端的A 3340和A 3342為模板分子，分別制備了相應的以二乙烯基苯為交聯(lián)劑，1，3二芳基脲為功能單體的分子印跡聚合物，進而以該分子印跡聚合物為固相萃取柱的固定相，用于對腦脊髓液血清中A 3340和A 3342以及母肽A 140和A 142的分離富集，免疫印跡法對洗脫液中A舛屜募澳鴿牡暮糠治黿峁礱鰨霉菇ǖ姆腫佑4.2色譜

色譜法是利用物質(zhì)在固定相和流動相中選擇性分配的差異實現(xiàn)對不同物質(zhì)分離的方法。常見的色譜分析法往往需要對樣品進行富集、凈化和提純，過程復雜、耗時。尤其是對生物體內(nèi)的疾病標記物等生物分子，基底復雜，存在大量的結(jié)構(gòu)類似的干擾物質(zhì)。因此，對疾病標記物分子的凈化、提純更為復雜和繁瑣，使得疾病標記物在分離提取過程中常存在選擇性差、靈敏度低等問題。將色譜分析技術(shù)與分子印跡技術(shù)相結(jié)合，則可以很好地克服上述難題。目前，MIPs作為色譜固定相已用于氨基酸及其衍生物、肽、甾醇、糖及其衍生物、藥物等的手性分離研究[32，33]。Kitahara等[34]將制備的單分散膽固醇分子印跡聚合物顆粒填入高效液相色譜柱，利用MIPs的良好選擇性，實現(xiàn)了膽固醇分子與結(jié)構(gòu)類似分子混合物的快速分離，不僅出峰時間短，還大大促進了反應動力學速率。Huang等[35]以二甲基丙烯酸乙二醇酯為交聯(lián)劑，以合成的膽固醇分子印跡聚合物顆粒為色譜柱的固定相，實現(xiàn)了膽固醇與結(jié)構(gòu)相似分子獯貧嫉母咝Х擲氌梅ㄎ扌杞蟹治鑫锏腦ご恚僮骷虻タ燜佟elépée等[36]以5甲基尿嘧啶核苷為模板分子，丙烯酰胺和乙烯苯基硼酸酯為功能單體，季戊四醇三丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑合成印跡聚合物，將其填入高效液相色譜柱中作為固定相，利用合成的MIPs對5甲基尿嘧啶核苷的特異性識別作用，實現(xiàn)了尿液中腫瘤標記物嘧啶核苷的分離檢測，對惡性腫瘤的早期臨床診斷具有重要的指導意義。Longo等[37]以合成的水溶性1甲基腺苷印跡聚合物為高效液相色譜固定相，利用聚合物對極性1甲基腺苷的強吸附能力，實現(xiàn)了目標物1甲基腺苷與腺苷、胞嘧啶核苷、次黃嘌呤核苷等干擾物質(zhì)的快速分離。對尿液樣本、含有1甲基腺苷的尿液樣本以及經(jīng)過該萃取系統(tǒng)分離后的洗脫液的高效液相色譜分析結(jié)果表明，該方法可用于人體尿液中1甲基腺苷的高效識別、分離和預富集?？梢姡肿佑≯E與色譜技術(shù)的結(jié)合，為腫瘤的早期診斷及其發(fā)展過程監(jiān)測提供了可能。

5疾病標記物分子印跡在傳感分析中的應用

傳感器是指能直接感受檢測物被測參數(shù)的變化，并把被測參數(shù)轉(zhuǎn)化為易于運輸、處理、測量信號的裝置，主要由敏感元件和信號轉(zhuǎn)換元件組成。以MIPs為傳感器的敏感元件，將其與被測物的相互作用通過各種電、熱、光等手段轉(zhuǎn)換成可測信號，可實現(xiàn)待測物的靈敏性和選擇性定量分析。這類傳感器除了具有生物傳感器較高的選擇性和靈敏度外，還能耐酸堿、耐有機溶劑、以及不受苛刻環(huán)境因素的影響，具有穩(wěn)定性好、壽命長等優(yōu)點[38]。自1987年Tabushi首次用分子印跡聚合物作為敏感材料對維生素進行檢測以來，分子印跡聚合物傳感器引起了人們的廣泛關(guān)注[39]。目前，分子印跡聚合物傳感器根據(jù)轉(zhuǎn)換器測量原理的不同分為質(zhì)量式、電學式和光學式3種。以下重點介紹利用疾病標記物分子印跡聚合物為敏感元件構(gòu)建的3種傳感器。

5.1石英晶體微量天平傳感器

石英晶體微天平是一種非常靈敏的質(zhì)量檢測儀器，它利用石英晶體諧振器的壓電特性，將石英晶體電極表面的質(zhì)量變化轉(zhuǎn)化為石英晶體振蕩電路輸出電信號的頻率變化。以分子印跡聚合物為分子識別元件的石英晶體微天平傳感器，利用選擇性吸附分析物前后引起的質(zhì)量變化對待分析物進行高靈敏檢測，QCM作為微質(zhì)量傳感器具有結(jié)構(gòu)簡單、振動Q值大、靈敏度和測量精度高等優(yōu)點，廣泛用于氣體液體成分分析、微質(zhì)量測量以及薄膜厚度檢測等領(lǐng)域。Kugimiya等[40，41]將QCM電極用烯丙基硫醇預處理引入乙烯基，然后將含有對乙烯基苯基硼酸唾液酸酯、乙二醇雙（甲基丙烯酸酯）、甲基丙烯酸N，N，N三甲基銨乙酯、甲基丙烯酸2羥乙酯、2，2′偶氮雙（二甲基戊腈）以及N，N二甲基甲酰胺的預聚合混合液滴加在電極表面，用三甲基氯硅烷處理過的蓋玻片覆蓋后，紫外光照引發(fā)聚合制備目標分子唾液酸的MIPs膜，用于選擇性識別唾液酸，根據(jù)識別唾液酸前后QCM振蕩頻率的變化，實現(xiàn)了對唾液酸的靈敏性檢測。Tai等[42]以丙烯酸和丙烯酰胺為單體，采用紫外光引發(fā)聚合，在QCM芯片表面制備了登革熱病毒表面NS1蛋白的MIPs，利用洗脫模板分子后的印跡空腔重新結(jié)合NS1蛋白，再在NS1蛋白上連接單克隆抗體，根據(jù)連接抗體前后的質(zhì)量變化引起的QCM頻率的改變，實現(xiàn)了對登革熱毒NS1蛋白的高靈敏檢測，檢出限低至5 靏L。最近，Tai等[43]以炭疽保護性抗原的線性表位基（一種五肽）為模板分子，在QCM芯片表面制備了識別炭疽保護性抗原的MIPs，實現(xiàn)了ng級體外炭疽保護性抗原的檢測。Yang[44]等以多巴胺為功能單體，含有35個氨基酸殘基（與糖蛋白41一段氨基酸殘基相同）的肽鏈為模板分子，在QCM表面聚合形成MIPs，構(gòu)建了人類免疫缺陷病毒1（HIV1）疾病標記物糖蛋白41的分子印跡仿生傳感器，對HIV1的檢出限低至2 靏L，可滿足實際尿樣中HIV1疾病標記物糖蛋白的檢測。

5.2電化學傳感器

電化學傳感器基于待測物的電化學性質(zhì)，將待測物的化學量轉(zhuǎn)變成電學量進行傳感檢測的一種傳感器，具有良好的選擇性和敏感性。由于疾病標記物通常是一些氨基酸、核苷酸、多肽、蛋白質(zhì)等生物分子，在生物體液中大都具有種類繁多的類似物，如果將特異性識別疾病標記物的分子印跡聚合物制成電化學傳感器的傳感元件，則可顯著提高電化學傳感器對疾病標記物的選擇性。Piletsky等[45]以膽固醇為模板分子，在金電極表面自組裝十六基硫醇，形成疏水單分子層印跡膜，洗脫模板分子后，在印跡膜修飾電極表面形成膽固醇分子印跡空腔，K3Fe（CN）6探針分子可通過印跡空腔到達電極表面?zhèn)鬟f電子而產(chǎn)生電信號，當印跡空腔中重結(jié)合膽固醇分子后，阻礙了K3Fe（CN）6分子向電極表面的傳輸，使得K3Fe（CN）6在電極表面的電信號下降，據(jù)此實現(xiàn)了膽固醇分子的靈敏性、特異性和快速識別檢測。Aghaei等[46]在金電極表面電聚合功能單體2巰基苯并咪唑形成膽固醇MIPs膜，構(gòu)建了電容型傳感器，基于雙電層理論，對膽固醇分子進行了高靈敏、實時、免標記分析檢測，對抗壞血酸、苯酚、色氨酸、維生素D2等干擾物質(zhì)的選擇性系數(shù)檢測結(jié)果表明，該電容型傳感器對目標分子膽固醇有良好的選擇性。Viswanathan等[47]在立體納米金電極表面電聚合多元酚膜制備卵巢癌標記物抗原125的MIPs，洗脫模板分子后形成印跡空腔，此時溶液中的分子探針K4Fe（CN）6分子能夠到達電極表面進行電子交換，當印跡空腔重結(jié)合抗原125分子后，則阻礙了K4Fe（CN）6分子向電極表面的傳輸，根據(jù)印跡空腔重結(jié)合抗原125分子前后產(chǎn)生的電信號改變，實現(xiàn)了對卵巢癌病人血清樣本中抗原125分子的靈敏性檢測，所得結(jié)果與酶聯(lián)免疫吸附法測定結(jié)果相一致，為卵巢癌的早期臨床診斷及其發(fā)展過程監(jiān)測提供了可能。

5.3表面等離子體共振型的傳感器

表面等離子體共振（Surface plasmon resonance，SPR）傳感技術(shù)是一項新興的生物化學檢測技術(shù)，與傳統(tǒng)的生化分析方法相比，SPR傳感技術(shù)具有免標記、實時、無損傷檢測等優(yōu)點，在生物科技、藥物篩選、臨床診斷、食物檢測及環(huán)境監(jiān)測、膜生物學等領(lǐng)域得到了越來越廣泛的應用。SPR是一種物理光學現(xiàn)象，由入射光的電磁波和金屬導體表面的自由電子形成的電荷密度波相互作用而產(chǎn)生。這種沿著金屬導體（金、銀）表面?zhèn)鞑サ碾姾擅芏炔ǎū砻娴入x子波）是一種消逝波，它在金屬內(nèi)部的分布隨著與表面垂直距離的增大呈指數(shù)衰減。SPR對附著在金屬表面的電介質(zhì)的折射率非常敏感，而折射率是所有材料的固有特征。因此，任何附著在金屬表面的電介質(zhì)均可被檢測，不同電介質(zhì)的表面等離子角不同，而同一種電介質(zhì)，其附著在金屬表面的量不同，則SPR響應強度也不同?；诖嗽?，采用分子印跡技術(shù)構(gòu)建SPR傳感器，將分子印跡技術(shù)的高特異性和SPR的高靈敏性相結(jié)合，可用于多種生化指標的準確、靈敏、快速檢測。Kugimiya等[48]先將模板分子、功能單體、交聯(lián)劑等混合液滴加在蓋玻片上，再將SPR芯片蓋在上面，通過紫外光引發(fā)聚合反應生成唾液酸分子印跡聚合物，洗脫模板分子后即形成唾液酸分子印跡SPR芯片，構(gòu)建了檢測唾液酸的SPR傳感器，用于選擇性識別神經(jīng)節(jié)苷酯中非還原性末端的唾液酸。Denizli等[49]以乙型肝炎B表面抗體（HBsAb）為模板，以羥乙基N甲基丙烯?；鵏酪氨酸甲酯為功能單體，在烯丙硫醇修飾的SPR芯片上制備HBsAb印跡膜，構(gòu)建了分子印跡SPR傳感器，用于人體血清中HBsAb的高靈敏檢測，檢測結(jié)果與酶聯(lián)免疫法相一致。雖然目前SPR傳感器在疾病診斷領(lǐng)域的應用較少，然而，對比現(xiàn)有臨床方法，該方法的靈敏度和精確度均較高，對疾病的早期診斷和預后治療具有重要意義。

6結(jié)論與展望

本文對疾病標記物分子印跡方法、印跡材料以及疾病標記物MIPs在分離和傳感分析中的應用進行了詳細介紹。分子印跡技術(shù)在重大疾病標記物分離檢測中的應用，對疾病的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療具有重要意義。疾病標記物分子印跡聚合物的制備及其在分離和傳感中的應用已成為分子印跡技術(shù)的重要發(fā)展方向。但是，疾病標記物種類繁多、性質(zhì)各異，目前研制的疾病標記物分子印跡聚合物只是其中的一小部分。對疾病的早期診斷，依賴于臨床上對疾病標記物的準確鑒定和篩選，進而結(jié)合分子印跡技術(shù)的高特異性構(gòu)建相關(guān)疾病標記物的識別檢測系統(tǒng)，實現(xiàn)對多種疾病的早期檢測及其發(fā)展過程的監(jiān)測。基于以上分析，疾病標記物的分子印跡的發(fā)展可能集中在以下幾個方面：（1）深入研究相關(guān)機理，開發(fā)和尋找性能優(yōu)良的新型功能單體、交聯(lián)劑，發(fā)展新的印跡方式； （2）利用計算機輔助分子設計，預測功能單體與模板分子之間的結(jié)合和相互作用[50]，實現(xiàn)更多疾病標記物的高效印跡，避免大量盲目的嘗試實驗； （3）深入抗原決定基分子印跡聚合物制備方法的研究，避免因疾病標記物的結(jié)構(gòu)復雜及易變對印跡效果的影響； （4）發(fā)展聯(lián)合印跡方法[51]，將互補的多種疾病標記物同時印跡，實現(xiàn)多目標疾病標記物的同時識別檢測，提高疾病檢測的準確率及早期診斷的可能性。