摘要：使用雙梯度液相色譜系統(tǒng)紫外檢測(cè)器，建立了二維液相色譜法全自動(dòng)、快速、同時(shí)測(cè)定嬰幼兒奶粉中維生素A，D3，E的含量。采用了非水反相系統(tǒng)，以Acclaim C18柱為一維分析柱，Acclaim PAⅡC18柱為二維分析柱。利用一維色譜柱完成維生素A和E的分離測(cè)定和維生素D的凈化分離；利用二維色譜柱完成維生素D的分析。一維分析以乙腈甲醇體系作為流動(dòng)相，流速0.6 mLmin；二維分析以乙腈異丙醇體系作為流動(dòng)相，流速0.8 mLmin，梯度洗脫。檢測(cè)波長(zhǎng)為325， 296和263 nm，采用波長(zhǎng)切換方式，整個(gè)分析過(guò)程僅需28 min。維生素D3在 20～2000 靏L范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r為0.9998，平均回收率為100.7%；維生素A在1.71～855 mgL濃度范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r為0.9979，平均回收率為114%；維生素E在 4.12～1030 mgL范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)r為0.9995，平均回收率為94.0%。本方法可快速準(zhǔn)確測(cè)定嬰幼兒乳品中維生素A、D3和E的含量。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜； 二維色譜柱； 雙樣充系統(tǒng)；嬰幼兒配方奶粉；維生素D； 維生素A； 維生素E

1引言

嬰幼兒配方奶粉又稱為母乳化奶粉，是一種以牛乳（或其它動(dòng)物乳）為主要原料，通過(guò)調(diào)整成分模擬母乳，可供嬰幼兒生長(zhǎng)和發(fā)育所需要的一種人工食品[1]。根據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中有關(guān)奶粉營(yíng)養(yǎng)成分規(guī)定，維生素指標(biāo)中必須強(qiáng)化的包括維生素A、維生素D和維生素E及其它水溶性維生素等；其中維生素D在實(shí)際母乳中含量極低，約為4～40 IU（國(guó)際單位）L（0.1-1.0靏L）[2～4]，主要對(duì)應(yīng)形式為維生素D3和25OH 維生素D3[4，5]，因此通常將維生素D3制成水可分散性的微粒形式，添加到嬰幼兒強(qiáng)化奶粉中[5，6]。關(guān)于奶粉中維生素A、D和E的測(cè)定方法的報(bào)道較多，其中高效液相色譜法是常用的分析方法。由于樣品基質(zhì)復(fù)雜，3種維生素對(duì)溫度、光照、氧氣和極端的pH值較敏感，且多數(shù)經(jīng)過(guò)包被后再添加到食品基質(zhì)中[7]，因此分析方法常包括皂化破壁、有機(jī)溶劑萃取，濃縮和凈化等步驟[8，9]，在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)分析方法中[9]， 需采用正相制備色譜、反相分析色譜兩套儀器，分別進(jìn)行凈化制備和分析，前處理過(guò)程極其繁瑣，大大影響樣品分析效率。本研究采用在線二維柱切換高效液相色譜紫外檢測(cè)法，樣品經(jīng)過(guò)皂化、萃取后，直接進(jìn)樣，同時(shí)完成維生素A， D和E的分析測(cè)定，提高了方法的準(zhǔn)確性和樣品分析效率。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

3結(jié)果與討論

3.1二維色譜流路構(gòu)建和閥切換時(shí)間的確定

維生素A和E在配方奶粉中含量較高，樣品經(jīng)過(guò)皂化萃取后，可直接在一維色譜柱中實(shí)現(xiàn)分離。維生素D含量較低，且樣品基質(zhì)干擾較大，原標(biāo)準(zhǔn)方法需經(jīng)過(guò)正相制備色譜的凈化，將含有維生素D的餾分蒸干定容后，再在反相色譜上進(jìn)行分析[9]。本研究采用二維色譜分離的中心切割法，樣品在一維色譜柱實(shí)現(xiàn)初步分離后，將含有維生素D的餾分切割至二維色譜柱中進(jìn)行分離。系統(tǒng)連接圖見(jiàn)圖1。

為確定右側(cè)閥的準(zhǔn)確切換時(shí)間，實(shí)驗(yàn)將一維色譜柱直接與UV連接，進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定維生素D2的出峰時(shí)間和維生素D3完全洗脫出色譜柱的時(shí)間。由于外界因素影響，維生素D的保留時(shí)間會(huì)有微小波動(dòng)，切割的時(shí)間窗太窄容易造成目標(biāo)物的損失；時(shí)間窗太寬，會(huì)使切換到二維分離柱的溶劑體積過(guò)大，對(duì)二維分離產(chǎn)生溶劑效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)連續(xù)進(jìn)樣，考察了保留時(shí)間波動(dòng)范圍，確定了最終的切換時(shí)間。在一維色譜分離中，維生素A和E在12 min內(nèi)即可完成分離過(guò)程，而在二維色譜分離中維生素D的保留時(shí)間約為21～22 min，因此方法采用二位置六通閥實(shí)現(xiàn)了色譜柱后的紫外檢測(cè)器共用。左側(cè)閥的切換時(shí)間定在12 min，在12 min之前，一維色譜柱與檢測(cè)器連接；在12 min之后，二維色譜柱與檢測(cè)器連接，從而實(shí)現(xiàn)維生素A、D和E的同時(shí)檢測(cè)。閥切換時(shí)間見(jiàn)表2。

3.2色譜分離條件選擇

在色譜分離模式選擇上，文獻(xiàn)[10]采用正相色譜或反相色譜法進(jìn)行分析。反相色譜法的優(yōu)勢(shì)是可以將維生素D2、D3以及維生素D前體和非活性的異構(gòu)體分開(kāi)，因此可以選擇維生素D2作為內(nèi)標(biāo)，以補(bǔ)償在前處理過(guò)程中維生素D3的損失，提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性[10]。另外，考慮到流動(dòng)相的兼容性，本實(shí)驗(yàn)在一維色譜和二維色譜分離中均采用反相色譜法。