摘要：建立了混合萃取劑懸浮固化分散液相微萃取聯(lián)合高效液相色譜測定尿中苯巰基尿酸（Sphenylmercapturic acid，SPMA）的方法。優(yōu)化了微萃取的實(shí)驗(yàn)條件，取20 mL尿樣并調(diào)節(jié)至pH 2.0，加入7.2 g固體NaCl，并振蕩溶解；以100 霯十二醇三氯甲烷（1.8∶1， VV）混合溶劑作為萃取劑， 100 霯甲醇作為分散劑，振搖使萃取劑分散于樣液中；離心使萃取劑懸浮于樣品溶液表面，_Symbolm@@_20 ℃冷凍至有機(jī)相凝固，轉(zhuǎn)移凝固的萃取劑至EP管，室溫下融化，離心后取上清液進(jìn)樣分析。苯巰基尿酸在0.025 ～1.25 mgL濃度范圍內(nèi)線性良好，方法檢出限為0.019 mgL，日內(nèi)精密度與日間精密度分別為2.2%～5.4%和2.5%～6.1%，將方法用于實(shí)際尿樣的分析，取得了較滿意的結(jié)果，加標(biāo)回收率在86.8%～99.9%之間。本方法簡便快捷、適合尿樣批量分析。

關(guān)鍵詞：混合萃取劑；懸浮固化分散液相微萃取；高效液相色譜法；苯巰基尿酸；尿樣

1引言

苯是一種中等毒性的有機(jī)化合物，主要對人體中樞神經(jīng)和造血系統(tǒng)產(chǎn)生損害。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)在1982年將苯確定為人類致癌物。苯接觸的生物監(jiān)測可以作為苯環(huán)境監(jiān)測的補(bǔ)充。目前，尿中的反式反式粘糠酸和苯巰基尿酸（Sphenylmercapturic acid，SPMA）是最為常用的生物監(jiān)測指標(biāo)。SPMA作為苯的特異性代謝產(chǎn)物，個體差異影響較小，在評價低濃度苯接觸時，尿中SPMA作為生物監(jiān)測指標(biāo)具有較為明顯的優(yōu)勢[1]。

尿中SPMA的檢測方法主要有液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[2]、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[3]、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)[4]以及高效液相色譜法[5]等。其中，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)在人工抗原的制備和抗體純化技術(shù)方面還有待完善[6]。亦有學(xué)者將氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜引入SPMA的分析，但需經(jīng)過衍生才能取得較好的靈敏度[3]。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法靈敏準(zhǔn)確，同時還能提供待測樣品的結(jié)構(gòu)信息，但所要求的儀器設(shè)備價格昂貴，在我國基層的衛(wèi)生單位難以普及。作為國內(nèi)最常配備的高效液相色譜紫外檢測系統(tǒng)同樣可用于SPMA的檢測，日本學(xué)者Inoue運(yùn)用此法檢測尿中的SPMA，檢出限能達(dá)到20 靏L[5]。因此，若輔以簡單重現(xiàn)和富集倍數(shù)良好的樣品前處理技術(shù)，高效液相色譜紫外檢測方法可望作為基層職業(yè)苯接觸生物監(jiān)測篩查分析時的首選方法。

傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)，如液相萃取、固相萃取等，存在或操作繁瑣耗時，或需大量有毒有機(jī)溶劑等缺點(diǎn)。為了實(shí)現(xiàn)樣品前處理的環(huán)保高效，近年來發(fā)展了多種微萃取技術(shù)，如固相微萃取、液相微萃取等。2007年， Zanjani等在液相微萃取的基礎(chǔ)上首次提出懸浮固化液相微萃?。⊿olidification Floating Organic Drop Liquid Phase Microextraction，SFOLPME）技術(shù)[7]，該方法操作簡單、富集倍數(shù)高、有機(jī)溶劑易取出，在痕量分析領(lǐng)域具有較為廣闊的應(yīng)用前景。但是，能滿足SFOLPME模式要求的萃取劑往往具有較長的碳鏈，僅對一些親脂性或者弱極性的分析物有較高的萃取率，在測定極性較大的物質(zhì)時往往達(dá)不到理想的效果。本研究通過在常規(guī)萃取劑中加入合適比例的極性有機(jī)溶劑，引入極性更強(qiáng)的混合萃取劑，可達(dá)到既滿足SFOLPME萃取模式的要求，又能夠有效地解決不同目標(biāo)物萃取效率的目的，擴(kuò)展了SFOLPME的應(yīng)用范圍，并結(jié)合HPLCUV完成了尿中SPMA的分析，取得了較為滿意的結(jié)果。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

高效液相色譜儀（AKTA purifier， GE Healthcare， 美國General Electric公司）， 附紫外檢測器。

2.2.3液相色譜條件Platisil ODS C18色譜柱 （150 mm × 4.6mm×5 靘）；柱溫：室溫；流動相A相為甲醇， B相為0.1 molL乙酸， 以體積比1∶1混勻。流速1.0 mLmin；檢測波長205 nm。手動進(jìn)樣，進(jìn)樣體積10 霯。

2.2.4SPMA工作曲線用甲醇將SPMA標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 gL）分別稀釋成5， 10， 25， 50， 100和250 mgL標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。取7只具塞離心管，其中一只加入空白尿樣20 mL作為空白對照，另外6只分別加入上述標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液各0.1 mL，并以空白尿樣定容至20 mL，配制成SPMA濃度為0， 0.025， 0.050， 0.125， 0.250， 0.500和1.25 mgL標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。按照2.2.2和2.2.3節(jié)的進(jìn)行樣品處理和色譜分析，以SPMA濃度值為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

3結(jié)果與討論

3.1微萃取條件優(yōu)化

3.1.1萃取劑種類及組成比例對于SFOLPME模式，最常用的萃取劑有十一醇、十二醇、1溴代十六烷、正十六烷等?？紤]到SPMA極性較強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)選擇單獨(dú)使用十一醇、十二醇和1溴代十六烷作為萃取劑，經(jīng)過一系列條件優(yōu)化后，結(jié)果表明，單獨(dú)使用這3種萃取劑時，SPMA的回收率一直低于20%。

結(jié)果表明，在25～100 霯之間，SPMA的回收率隨著體積增加逐漸上升；在100～200 霯之間，回收率基本保持恒定。綜合考慮回收率和富集倍數(shù)，選擇100 霯混合萃取劑用于SPMA 的萃取。

3.1.3分散劑的選擇分散劑是一種既可以溶于水，又能與萃取劑互溶的有機(jī)溶劑，分散劑的加入可使萃取劑以微小液滴高度分散于水相，形成良好的水分散劑萃取劑的乳濁體系，加大萃取劑與樣品溶液的萃取面積，縮短萃取時間，提高萃取效率。

本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇、乙腈、丙酮各150 霯作為分散劑，分別加入100 霯十二醇三氯甲烷（1.8∶1， VV）混合萃取劑。結(jié)果表明，當(dāng)加入分散劑后，樣品溶液很容易分散，形成乳濁液，SPMA萃取效率亦有增加。3種分散劑中，甲醇和乙腈能得到更高的萃取效率，考慮到標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇配制，因此實(shí)驗(yàn)選擇甲醇作為分散劑，并在此基礎(chǔ)上，在50～300 霯范圍內(nèi)考察了甲醇體積對萃取效率的影響。結(jié)果表明，在甲醇加入量小于200 霯時，隨著甲醇體積的增加，SPMA的萃取效率增加，80～150 霯范圍內(nèi)萃取效率達(dá)到穩(wěn)定；但當(dāng)甲醇體積超過200 霯后，SPMA的萃取效率反而有所下降，分析可能因?yàn)榉稚┘尤脒^多，使得SPMA在水相中的溶解度增大。因此，實(shí)驗(yàn)選定甲醇體積為100 霯。

3.1.4萃取體系的pH值尿樣的酸度對SPMA在水相中的存在方式有著較大的影響，從而影響其萃取效率。Paci等[10]發(fā)現(xiàn)，在尿樣中加入適量H2SO4后，再用堿性溶液將其調(diào)至酸性（pH=2），再進(jìn)行提取分析，測得SPMA含量是生理尿液（pH=5～7）中的2倍，[TS（][HT5”SS]圖3萃取體系的pH值對萃取效率的影響

Fig.3Effect of pH value of extraction system on extraction efficiency[HT5][TS）]其機(jī)制是尿中的SPMA前體preSPMA能夠在強(qiáng)酸性環(huán)境中轉(zhuǎn)化成為SPMA，且pH=2.0時，有機(jī)溶劑提取效率最高。本研究以9 molL H2SO4將SPMA前體轉(zhuǎn)化后，加入7.8 molL KOH調(diào)整樣品溶液pH值后，再進(jìn)行萃取，并在pH 1.0～6.0的范圍內(nèi)考察了萃取體系pH值對萃取效率的影響，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，當(dāng)萃取體系pH=2.0時，萃取效率最高，隨著體系pH值升高，萃取效率逐漸降低；當(dāng)pH≥5.0時，幾乎沒有SPMA被提取。實(shí)驗(yàn)最終采用萃取pH值為2.0。

3.2色譜條件選擇

實(shí)驗(yàn)在文獻(xiàn)基礎(chǔ)上考察了色譜分離分析條件[9]，包括色譜柱類型、檢測波長、流動相配比、流速、柱溫等指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)最終選定的色譜條件為：Platisil ODS C18色譜柱 （150 mm×4.6mm×5 靘），檢測波長為205 nm，流動相為甲醇0.1 molL乙酸（1∶1，VV），等度洗脫，流速為1.0 mLmin，柱溫為室溫。在此色譜條件下，待測物和樣品雜質(zhì)能得到較好地分離，并且能滿足實(shí)驗(yàn)的基本要求。

在優(yōu)化的色譜條件下得到的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖5，SPMA的保留時間約為7.2 min。

3.4樣品分析

隨機(jī)抽取家具廠職業(yè)苯接觸人群和非職業(yè)苯接觸吸煙人群（15～40 cigarettes per day）尿樣各10份，采用本方法進(jìn)行分析，職業(yè)苯接觸人群尿樣中的SPMA測得值為0.14～0.21 mgL，非職業(yè)苯接觸吸煙人群的測得值為0.019～0.059 mgL。典型的樣品色譜圖見圖6。結(jié)果表明， 所建立的測定尿中苯巰基尿酸SFODLLMEHPLC分析方法，操作簡便快捷，對環(huán)境友好，適于尿樣批量分析。方法的各項(xiàng)指標(biāo)均滿足生物材料樣品的分析要求（《研制生物樣品監(jiān)測檢驗(yàn)方法指南》，WST 681996）。