摘要：利用焦磷酸測序技術進行核酸序列測定時，測序信號過低或非特異性信號過高均會導致測序失敗。因此， PCR引物與測序引物的設計十分重要。本研究以rs8175347為例，通過設計具有不同多聚酶親和指數（PPI）的PCR引物，并運用焦磷酸測序測定其擴增產物，考察了PPI值對擴增效率以及測序信號的影響；以rs914232、rs671位點為例，對比不同測序方向以及dNTP的推注順序，考察了兩者對測序結果的影響。結果表明，提高PCR引物的PPI值有助于增強擴增效率與測序結果的信號峰強度，測序方向和dNTP推注順序的不合理選擇會嚴重干擾部分SNP測序結果的判斷。因此，在設計PCR引物時，應將多聚酶親和指數理論與傳統基于解鏈溫度值的引物設計思路相結合，為焦磷酸測序提供高質量的測序模板；在進行定量測序時，還要綜合考慮待測位點（SNP）兩側的序列，選擇合適的測序方向以及dNTP的推注順序，使測序結果更加準確。

關鍵詞：焦磷酸測序； PCR引物； 測序引物

1引言

焦磷酸測序技術[1]的測序原理是： 引物與模板DNA退火后， 在DNA 聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、熒光素酶和三磷酸腺苷雙磷酸酶等4 種酶的協同作用下完成循環(huán)測序反應。當加入的dNTP與模板互補時，1 pmol DNA模板與互補的dNTP聚合時可以產生等摩爾PPi，在三磷酸腺苷硫酸化酶的催化下，PPi與5′磷酸化硫酸腺苷反應生成等量的ATP；熒光素酶催化作用下，ATP與蟲熒光素反應生成氧化蟲熒光素并發(fā)出等量的可見光，可用光電轉換裝置檢測。產生的熒光信號以峰的形式出現，其強度與聚合的dNTP 個數成正比，根據加入的dNTP類型和測得的熒光信號強度就可實時記錄模板DNA 的核苷酸序列。

焦磷酸測序技術以其準確、快速、簡便的技術特點，在單核苷酸多態(tài)性分析[2，3]、等位基因頻率測定[4，5]、微生物鑒定分型[6，7]、甲基化分析[8]、表達量測定[9]等方面的應用中展現了巨大的優(yōu)勢。然而，在利用焦磷酸測序技術進行核酸序列測定時，常因測序信號過低或出現過高的非特異性背景信號而使測序失敗，無法得到正確的核酸序列信息，前者主要由于PCR擴增引物的擴增效率不高，造成擴增產物濃度低，無法制備得到足夠多的單鏈測序模板；后者則是因為測序引物與模板在非待測區(qū)域產生錯配延伸或是測序引物自身形成了二聚體延伸產生了非特異性信號，干擾了測序結果。因此，要獲得準確可靠的焦磷酸測序結果，擴增引物與測序引物的設計十分重要，有必要系統研究焦磷酸測序中引物的設計方法。

測序結果的準確性既受擴增引物特異性的影響，也受測序引物特異性的影響。當測序引物3′末端與待測模板錯配或測序引物自身形成二聚體，產生的信號超過dNTP的本底信號時，焦磷酸測序中會出現非特異性信號，干擾結果的準確判讀。因此，精確設計測序引物3′末端的序列或調整擴增產物長度，可減少測序引物與待測模板其它區(qū)域的錯配，降低或消除非特異性測序信號。此外，優(yōu)化測序引物的序列， 可避免引物二聚體的生成，防止因二聚體的形成而大量消耗測序引物，降低測序信號或增加非特異性信號。

3.2提高焦磷酸測序定量性能的方法

運用焦磷酸測序對SNP分型時，不僅需要參照上述PCR引物和測序引物的設計原則，還應結合SNP附近的堿基序列，選擇待測位點的正義鏈或反義鏈， 盡量避免序列中的同質區(qū)，同時優(yōu)化dNTP加入順序，以獲得可準確分型的焦磷酸測序圖譜。

以測定rs671位點為例，當生物素標記下游引物時，測序引物延伸序列為GAAAGT。該位點為純合野生型或突變雜合型時，“G”、“A”信號峰強度比值應分別等于1∶2或1∶5。但在實際樣本的測序圖譜中，純合野生型和突變雜合型的“G”、“A”信號峰強度比值分別為1∶2（圖2a）和1∶3.6（圖2b），這一結果與理論值相差較大。

然而，若測定PCR產物反義鏈序列，測序引物延伸序列即為CTAG，判定純合野生型只要根據峰的有無，不需計算等位基因比例（圖2c）；對于雜合型的該位點，則“C”、“T”信號峰同時出現（圖2d）。理論上一次焦磷酸測序反應中，聚合dNTP的個數與信號峰強度成正比，但是如果一次聚合4個或4個以上dNTP，則可能出現測序誤差[12]。因此，為了準確直觀地測定基因型，需對比待測位點附近正義鏈與反義鏈的序列，避免在同質區(qū)一次性聚合多個dNTP。

對有些SNP位點，不能簡單通過選擇正義鏈或反義鏈來回避SNP附近復雜的堿基組成。以位于21號染色體上的rs914232位點為例（該位點雜合子的等位基因比例用于判定樣本是健康人或唐氏綜合癥患者），針對該位點無論選擇正義鏈或反義鏈，都無法使測序結果中雜合子的等位基因比例為1∶1（健康人），1∶2或2∶1（唐氏綜合癥患者）。研究發(fā)現，通過優(yōu)化測序時dNTP的加入順序，焦磷酸測序圖譜能較好區(qū)別健康人雜合子和唐氏綜合癥患者雜合子。如圖3所示，當dNTP以“TCAG”的順序加入時，健康人雜合子和唐氏綜合癥患者雜合子的“C”、“T” 信號峰強度比值分別為3∶1（圖3a）和5∶1（圖3b），兩種基因型的焦磷酸測序圖譜差異非常明顯。但是，當dNTP以“CTAG”順序加入時，健康人雜合子和唐氏綜合癥患者雜合子的“C”、“T”信號峰強度比值分別為1∶1.5（圖3c）和1∶1.25（圖3d），兩種基因型的焦磷酸測序圖譜差異不明顯，難以判斷臨床樣本的基因型。因此，為了得到準確的判斷結果，應根據待測靶標優(yōu)化dNTP的加入順序。

4結論

本研究通過分析3個不同SNP的測序結果，研究了焦磷酸測序中PCR引物與測序引物的設計方法。研究結果表明，將多聚酶親和指數理論與傳統依據Tm值的設計思路相結合，可顯著提高PCR引物的擴增效率，滿足了焦磷酸測序對模板量的要求；通過對比待測位點附近正義鏈與反義鏈的序列，合理選擇測序方向或dNTP的加入順序，有助于準確直觀地測定基因型并判斷結果。